缺血性视神经病变视网膜神经节细胞凋亡过程中cfos基因改变

作者：郭瑶，陈蕾，柳力敏，王敏芳    作者单位：中国沈阳市科技基金资助项目（No.1063237300）（110031）中国辽宁省沈阳市第四人民医院眼科 沈阳市眼病研究所；（110001）中国辽宁省沈阳市，中国医科大学附属第一医院眼底病中心 【摘要】  目的：研究缺血性视神经病变以抑制视神经节细胞损伤。方法：Wister大鼠80只，分为正常组和缺血性视神经病变组。缺血性视神经病变组按缺血时间不同分为0.25，0.5，1，2，4，6，12h等7个组。采用RTPCR方法检测缺血诱导的大鼠视网膜内不同时间cfos基因的表达情况。结果：正常大鼠视网膜cfos mRNA有少量表达,缺血可诱导cfos mRNA的表达,缺血0.25h后cfos mRNA的表达水平即开始增加,在1h左右达到最高,然后逐渐减少,12h后恢复到正常水平。结论：急性视网膜缺血,cfos基因表达为快速一过性。

【关键词】  缺血性视神经病变；cfos；大鼠

Change of cfos gene during the apoptosis of retinal ganglion cells of ischemic optic neuropathy

　　Yao Guo, Lei Chen, LiMin Liu, MinFang Wang

　　Foundation item: Science and Technology Foundation of Shenyang City, Liaoning Province, China（No.1063237300）

　　Eye Disease Institute of Shenyang, Shenyang 110031, Liaoning Province, China; Ocular Fundus Disease Center, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China

　　Abstract　　AIM: To prevent retinal ganglion cells (RGCs) from damage by studying the ischemic optic neuropathy (ION) models to conquer the blinding ophthalmocace.　　METHODS: Eighty Wister rats were divided into 2 groups: the control and the ION group. The ION group included 7 subgroups according to time 0.25, 0.5, 1 hour, 2, 4, 6 and 12 hours. RTPCR method was used to determine the cfos gene expression of ischemicinduced RGCs at different times.　　RESULTS: Small amount of cfos gene was detected in the control through RTPCR method and the ischemia can increase the expression of cfos mRNA at 0.25 hour and peaks at 1 hour and then gradually decreased to normal at 12 hours. 　　CONCLUSION: The cfos expression in the acute ION models is a fast and transient progress.　　KEYWORDS: ischemic optic neuropathy; cfos; rat

　　0引言    　　最近的研究证实，脑缺血导致基因表达与调控的大范围改变。例如，缺血导致cfos和cjun家族即刻早期基因的迅速表达，这些家族的基因产物相互作用以形成fosjun异质二聚体，这种聚体发挥所谓的AP1转录因子的作用，调节其他基因的表达。局部缺血引起cfos和cjun mRNA(54,55)的即时表达,这种表达在早期再灌注时达到顶点，在AP1黏着运动中增加了4～6倍。

　　1材料和方法

　　1.1材料  选用体质量为200g的Wister大鼠80只，实验前均散瞳查眼底，无血管走行异常、血晕良好和无视神经萎缩，在国家一级动物实验室饲养。按缺血时间不同分为0.25，0.5，1，2，4，6，12h等7个组,每只鼠右眼为缺血眼,左眼做自身对照组,另设正常对照组。9600型PCR仪Metreo德国，凝胶电泳分析系统Fluorchem美国Alfha公司，细胞图像分析仪器MetaMoph/C5050/BX41日本，紫外分光光度仪，Dullbecco改良Eagle培养基Dullbecco‘s modified Eagel’ medium（DMEM），新生牛血清杭州四季青生物工程材料研究所，胰蛋白酶1∶250 Difco Gibco，Trico，Takara公司，RTPCR一步法试剂盒，大连宝生物公司，Βaction引物，大连宝生物公司合成。

　　1.2方法  缺血性视神经病变模型制作见文献[1]。取提取的各组RPE细胞总RNA 2μL，分别加入OligodT23VN引物（50μmol/L）2μL，dNTP混合物（2.5μmol/L）4μL，加入DEPE水，使反应的总体积为20μL，70℃加热5min，短暂离心后放置冰上，取16μL混合物，加入10×RT反应缓冲液2mL，RNAase抑制剂1μL，MMuLV逆转录酶1μL，使反应总体积为20μL。42℃孵育1h，75℃5min使酶失活，加入RNaseH 1μL，37℃作用20min降解RNA，95℃酶失活，逆转录成cDNA。然后以cDNA为模板，进行PCR扩增。

　　图1  RTRCR检查正常条件下及缺血条件下cfos mRNA的表达  M：正常条件下；0：对照组；1：激光后0.25h；2：激光后0.5h；3：激光后1h；4：激光后2h；5：激光后4h；6：激光后6h；7：激光后12h。（略）

　　PCR程序扩增cfos反应体系为：PCR Buffer(Mg2+) 2.5μL,dNTP混合物（2.5Mm）4μL,cDNA 1μL,上游引物5TTGTGAAGTGCAAATGTTCTAAAGG3 0.5μL,下游引物5CAAGAAATCTCCCGTGAAAT3 0.5μL,Taq DNA polyme（5U/μL）0.25μL,ddH2O至25μL,扩增βactin反应体系为：PCR Buffer（Mg2+）2.5μL，dNTP混合物（2.5Mm）4μL，cDNA 1μL，上游引物：5AAATCGTGCGTGACATTAA3 0.5μL，下游引物：5CTCGTCATACTCCTGCTTG3 0.5μL，Taq DNA polymerase（5U/μL）0.25μL，ddH2O至25μL。反应条件：95℃模板变性2min共进行35个循环：95℃模板变性30s，退火45s，72℃延伸1min；其中cfos退火温度为56℃，扩增片断长度为301bp；βactin退火温度为63℃，扩增片断长度为461bp。最后72℃延伸15min，4℃15min。每组取RTPCR产物5μL，20g/L琼脂糖凝胶电泳，与DNA分子质量标记比较并拍照。应用凝胶电泳分析系统软件对PCRβ产物作定量分析，重复3次。自动电泳凝胶成像分析系统下成像对PCRβ扩增产物、内参βactin目的条带进行灰度扫描分析，FluorChen V2.0系统采集扩增条带的整合吸光度值，读取相对积分吸光度（A）。    　　统计学分析：数据用±s表示，采用方差分析进行统计学检验，P<0.05有统计学差异。统计过程均用SPSS 11.5软件进行。

　　2结果    　　正常条件下在大鼠视网膜cfos有少量的表达,缺血可诱导cfos mRNA的表达,缺血0.25h后cfos mRNA的表达水平即开始增加,在1h左右达到最高,然后逐渐减少,12h后恢复到正常水平（图1）。

　　3讨论    　　cfos是一种癌基因，包括神经元在内的绝大多数正常细胞中有低水平的表达，其表达产物是细胞核的磷酸蛋白(Fos蛋白)，后者形成DNA结合蛋白复合物并通过选择性的启动子刺激转录。蛋白质的功能由其本身的结构决定，大量研究结果已揭示了cFos蛋白功能与结构的密切关系。原癌基因cfos编码产物（cFos蛋白）为一个含有380氨基酸残基的蛋白质，病毒癌基因vfos编码产物vFos蛋白含有381个残基，与cFos前332个残基几乎相同，而C端差异很大。Fos蛋白有3个主要的功能区：（1）碱性DNA结合区，位于139～159残基处，包含12个碱性残基，是Fos蛋白的正电荷中心；（2）与DNA结合区紧邻的亮氨酸拉链区（Leucine Zipper Domain），位于165～193残基处；（3）C端转录调节区，位于332～380残基处。细胞在受到各种刺激后cfos迅速表达，表达产物维持时间短暂，故称早期快反应基因(immediate early genes，IEGS)。故我们在以往实验的基础上观察视网膜缺血0.25h后cfos基因的表达情况。许多研究证明脑缺血可诱导cfos基因在脑内的表达［2，3］。视网膜是中枢神经系统的外延部分，故从理论上讲视网膜缺血应该能够诱导cfos基因在视网膜内表达，本实验的结果验证了这一推论。视网膜缺血0.25h后其内核层即出现fos表达，缺血2h后达高峰，此结果与脑缺血的研究结果相吻合［4］。视网膜节细胞层在缺血0.5h后也出现fos表达，在缺血2h达高峰。Otori等采用结扎视网膜中央动脉的方法［5］，用免疫组化及原位杂交的方法检测缺血视网膜内cfos，cjun基因的表达情况。原位杂交结果显示cfos，cjun基因均有表达，而免疫组化方法只观察到Jun的表达，Fos免疫组化为阴性，其原因可能与cfos的激活机制有关。脑缺血的研究也有类似的报道［24］。cfos基因的表达因刺激手段，实验模型和实验方法不同而不同。目前认为即早基因(IEG)在多种细胞均能被诱导，但受细胞表型的限制，同一种刺激能引起不同表型的细胞表达不同量的IEG，许多刺激均可诱导IEG表达，但有相对的特异性［4］。在整体动物实验如颠痫模型和伤害性刺激IEG似乎能得到更广泛的表达，但目前的研究主要集中在对fos家族和jun家族的研究。大量的研究认为cfos，cjun等基因的表达是一过性的，但目前也有不少研究发现cfos，cjun的表达常会延迟出现，并可持续数周或数月［5，6］，故推测即早基因表达可能有几种模式快速一过性表达、延迟的一过性表达及持续的组织特异性表达［7］。我们未进行缺血诱导cjun的实验，但从本实验缺血视网膜cfos表达情况分析，本实验模型所诱导的cfos表达属快速一过性表达。不同的表达模式及其相应的机制和意义仍需做进一步探讨。

【参考文献】  　1郭瑶，陈蕾，王敏芳，等.孟加拉玫瑰红诱导的激光所致大鼠缺血性视神经病变模型制作.国际眼科杂志 2007；7（3）：703706

　　2 Mittag T, Schmidt KG. Mechanisms of neuroprotection against glaucoma. Ophthalmologe 2004；101（11）:10761086

　　3 Quigley HA, Nickells RW, Kerrigan LA, et al. Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis. Invest Ophthalmol Vis Sci 1995；36:774 786

　　4 Nickells RW. Retinal ganglion cell death in glaucoma: the how, the why, and the maybe. J Glaucoma 1996；5(5):345356

　　5 Iwata K, Tsuboi Y, Shima A, et al. Central neuronal changes after nerve injury: neuroplastic influences of injury and aging. J Orofac Pain 2004；18(4):293298

　　6 Oshitari T, Dezawa M, Okada S, et al. The role of cfos in cell death and regeneration of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002；43:24422449

　　7周历,张康兰,方以群,等.缺血再灌损伤对视网膜结构和功能的影响,中华眼科杂志 1998；34(2):134136