透镜诱导豚鼠近视眼巩膜基质中基质金属蛋白酶2及其组织抑制剂和生长因子的变化
发表时间：2010-02-03 浏览次数：521次
透镜诱导豚鼠近视眼巩膜基质中基质金属蛋白酶2及其组织抑制剂和生长因子的变化作者：胡萍 作者单位：山东大学齐鲁医院 眼科，山东 济南 【摘要】 目的 观察透镜诱导豚鼠近视眼巩膜基质中基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinases 2，MMP-2）、金属蛋白酶2组织抑制剂(tissue inhibitor of metaloproteinase 2，TIMP-2）和转化生长因子β2（transforming growth factor β2，TGF-β2）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，bFGF）的变化，探讨透镜诱导与形觉剥夺在近视眼发生机制上的异同点。方法 11只豚鼠于诱导前后分别验光、测量眼轴长度，用-6 D的透镜诱导右眼作为诱导眼，左眼作为对照眼，诱导成功后，将豚鼠处死，摘除眼球，取后极部巩膜分别进行MMP-2和TIMP-2、TGF-β2和bFGF的免疫组织化学染色，观察它们在巩膜组织成纤维细胞胞浆中表达的阳性率和阳性细胞所占面积的百分比，并与对侧眼进行比较。结果 11只豚鼠诱导眼成功诱导出（-3.31±1.04)D近视，诱导眼巩膜中MMP-2的阳性率为81.8％，对照眼为45.5%，差异有显著性；TIMP-2的阳性率36.4％，对照眼为72.7%；MMP-2染色阳性细胞面积百分比为0.22±0.15，对照眼为0.06±0.08（P<0.05）；TIMP-2为0.05±0.08，对照眼为0.13±0.10。巩膜中TGF-β2阳性率为81.8％，对照眼为36.4%(P<0.05)，bFGF的阳性率为45.5％，明显低于对照眼(63.6%)。诱导眼TGF-β2染色阳性细胞面积百分比为0.21±0.14，对照眼为0.06±0.10，差异有显著性；bFGF为0.07±0.09，对照眼为0.15±0.14。结论 透镜可以成功地诱导出豚鼠近视眼，透镜诱导近视眼巩膜基质中MMP-2活性增强，TIMP-2活性降低，TGF-β2表达增加，bFGF表达减少，MMP-2和TIMP-2、TGF-β2和bFGF之间存在平衡失调，它们的改变与形觉剥夺性近视的变化相似，表明透镜诱导近视眼与形觉剥夺性近视眼在巩膜基质的改变和生长因子的变化上存在相似的机制。 【关键词】 近视 豚鼠 动物模型 基质金属蛋白酶 眼轴延长和巩膜重塑是近视眼的主要改变，巩膜在调控眼球生长中起着重要作用，动物形觉剥夺性近视眼和人类近视眼的巩膜均出现细胞外基质和巩膜胶原纤维改变[1-2]。人们对鸡、树鼠、恒河猴等的形觉剥夺性近视眼的巩膜基质和生长因子的变化有较多研究，而目前有关透镜诱导豚鼠近视眼的巩膜基质和生长因子变化的相关报道较少见。本研究观察透镜诱导豚鼠近视眼巩膜基质中基质金属蛋白酶2及其组织抑制剂和生长因子的变化，从而探讨透镜诱导与形觉剥夺在近视眼发生机制上的异同点。1 材料和方法 1.1 实验动物 选择山东大学实验动物中心饲养的4周龄的花色豚鼠11只，右眼配戴镜片，为诱导眼，左眼为对照眼。 1.2 镜片的制备 选择-6 D的白树酯镜片，将它们制作成直径22 mm的圆形镜片，分别于3点、6点、9点、12点接近镜片的边缘处各打一个小圆孔，以备固定用。 1.3 主要试剂 武汉博士德生物工程有限公司提供的兔抗鼠的基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinases 2，MMP-2）、金属蛋白酶2组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP-2）、转化生长因子β2（transforming growth factor β2，TGF-β2）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，bFGF）的单克隆抗体原液，SABC试剂盒，DAB显色试剂盒。 1.4 方法 1.4.1 屈光度的检查 所有豚鼠在暗室内托吡酰胺散瞳状态下，用带状检影镜分别进行水平和垂直径线上的检影验光，测定豚鼠眼的屈光度，记录实际度数，散光以半量等效球镜计算。 1.4.2 眼轴长度的测量 豚鼠眼结膜囊内滴倍诺喜表面麻醉后，用动物专用A超仪测量眼轴长，测量时以手动模式连续测量10次，分别记录并计算其平均值，以均值作为眼轴长度。 1.4.3 动物模型的制作 在局部麻醉下，将树酯镜片用1号无创伤缝线经过4个边孔分别固定于豚鼠右眼睑周围的皮肤上，固定时注意不影响睑裂闭合。豚鼠在室内、自然光照下的自然昼夜周期饲养。诱导期间，每日用棉棒清洁镜片2次，并且观察镜片的固定位置。饲养14 d后去除镜片，按照实验前同样的方法进行检影验光并用A超测量眼轴长，记录结果。 1.5 标本的制作 将豚鼠注射空气处死，于角膜的中央水平径线处的鼻侧和颞侧角膜缘做标记，沿角膜缘剪开球结膜，立即摘除双侧眼球，沿角膜垂直径线剪开，分别置入快速固定液中固定，按常规逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡后包埋，5 ?滋m连续切片。 1.6 免疫组化染色 石蜡切片予常规脱蜡、水化，进行常规的免疫组化染色。显微镜观察。阳性对照：由武汉博士德公司提供的MMP-2、TIMP-2、TGF-β2和bFGF的阳性组织片作阳性对照。阴性空白对照：以PBS代替一抗，作阴性对照。 1.7 结果判定 1.7.1 光镜下随机选择观察后极部巩膜组织的成纤维细胞，以阳性细胞占细胞总数的百分比表示阳性表达程度：强阳性：>50%，中度阳性：25%～50%，弱阳性：5%～24%，阴性：<5%。 1.7.2 利用HPIAS-1000高清晰度彩色病理分析系统，用彩色分割方式测定每个视野中的阳性细胞的面积，计算阳性细胞面积占每个视野组织面积的百分比。 1.8 统计学方法 应用Wilcoxon法秩和检验和ｔ检验进行统计学分析。2 结果 2.1 实验前后诱导眼和对照眼眼轴和屈光度的变化（见表1） 诱导眼成功诱导出(-3.31±1.04）D近视，眼轴由（7.80±0.11）mm延长至（8.25±0.09）mm，与对照眼比较差异有显著性（P<0.05）。 2.2 MMP-2、TIMP-2、TGF-β2和bFGF在豚鼠近视眼后极部巩膜中的阳性表达率(见表2) 诱导眼与对照眼比较，MMP-2、TGF-β2的阳性表达率增高（P<0，05），TIMP-2、bFGF的阳性表达率减少。 2.3 MMP-2、TIMP-2、TGF-β2和bFGF免疫组化染色阳性细胞面积百分比的比较（见表3） 诱导眼和对照眼中各指标的变化与阳性表达率的变化一致。 巩膜组织成纤维细胞胞浆中MMP-2和TGF-β2免疫组化染色呈强阳性（见图1、图2）。3 讨论 豚鼠是一种温顺、价廉、易饲养的哺乳动物。对豚鼠巩膜结构的研究表明，它与人类巩膜相似，豚鼠近视眼也伴有后极部巩膜变薄，与其他哺乳动物的实验性近视眼的改变相似。有关豚鼠形觉剥夺性近视眼巩膜代谢的研究发现，巩膜的硫化糖胺多糖和羟脯氨酸含量明显降低，表明巩膜蛋白多糖和胶原等细胞外基质含量减少，巩膜变薄，易于扩张，眼轴延长，形成轴性近视，这些变化接近人类近视眼巩膜的改变[3-5]，因此，用豚鼠制作近视眼动物模型是有效可行的。我们用透镜诱导豚鼠近视眼取得成功，并且伴有眼轴的延长，其变化是有统计学意义的。 我们知道，形觉剥夺性近视眼巩膜重塑需要许多细胞外基质蛋白和酶的参与，包括巩膜结构成分，如胶原、蛋白多糖和蛋白酶。蛋白酶对巩膜细胞外基质合成和降解之间的精细平衡起重要作用，其中最主要的是MMP-2及其抑制剂TIMP-2。研究显示，MMP-2和TIMP-2之间的失衡在多种哺乳动物形觉剥夺性近视眼巩膜塑形中起重要作用[6-9]。有关形觉剥夺性近视眼巩膜变化的研究已经很多[10]，但有关透镜诱导的实验性近视眼巩膜变化的研究较少。我们成功地用透镜诱导出豚鼠近视眼模型，观察了豚鼠近视眼巩膜中MMP-2和TIMP-2的变化。结果显示，透镜诱导豚鼠近视眼巩膜组织中MMP-2的阳性表达率明显高于对照眼，TIMP-2的阳性表达率低于对照眼，与免疫组化染色阳性细胞所占面积百分比的分析结果一致，表明透镜诱导豚鼠近视眼巩膜组织中MMP-2的活性增强，TIMP-2的活性降低。这与其他哺乳动物形觉剥夺性近视眼的研究结果相似，说明透镜诱导和形觉剥夺引起巩膜基质的变化存在相似的机制，它们都可通过破坏基质蛋白酶的平衡，影响胶原的代谢，从而引起巩膜的重塑、眼轴的延长。 形觉剥夺可激活MMP-2，剥夺期和恢复期巩膜MMP-2的基因表达是不同的。MMP-2的基因表达受细胞因子和生长因子的调控，TGF-β和bFGF可能参与调控MMP-2的表达。在形觉剥夺性近视中TGF-β2的水平显著升高，bFGF的含量减少，它们可能分别在调节细胞的生长、分化和移行中，起“启动”和“停止”的信息作用，从而影响形觉剥夺性近视眼的发展[11-13]。我们不仅对豚鼠透镜诱导近视眼巩膜基质金属蛋白酶的平衡紊乱进行了研究，同时也观察了基质中TGF-β2和bFGF的表达，结果显示，透镜诱导豚鼠近视眼后极部巩膜基质中TGF-β2的阳性表达明显高于对侧眼，且有统计学差异；bFGF的阳性表达率低于对照眼的阳性表达率，并且与免疫组化染色阳性细胞所占面积百分比的结果一致，说明巩膜中TGF-β2的含量增加，活性增强，bFGF的含量减少，活性降低。与形觉剥夺性近视眼巩膜中TGF-β2和bFGF的变化相同，提示透镜诱导近视眼的形成和形觉剥夺性近视眼的发生，在巩膜生长因子的变化上是相同的，表明两种类型的近视眼形成中，生长因子的调节也存在相似的机制。 综上所述，豚鼠透镜诱导性近视眼与其他哺乳动物形觉剥夺性近视眼巩膜基质中蛋白酶的变化是一致的，MMP-2和TIMP-2的活性失衡在透镜诱导豚鼠近视眼巩膜重塑中起重要作用。由于TGF-β和bFGF分别在巩膜的生长中起“启动”和“停止”的信息作用，因此两者失去平衡影响了巩膜基质蛋白酶的活性，从而导致巩膜的异常生长。透镜诱导和形觉剥夺在近视眼巩膜基质变化的发生机制上存在相似之处。【参考文献】[1] 赵海岚，周翔天，吕帆. 近视发展中的巩膜病理改变及其影响因素[J]. 眼视光学杂志，2005，7（2）：139-141.[2] 孙朝晖，王超英，靳胜利，等. 实验性近视眼巩膜生物力学特征研究[J]. 眼视光学杂志，2006，8（4）：209-213.[3] 欧阳朝枯，褚仁远，胡文政. 哌仑西平对豚鼠透镜诱导性近视眼的作用[J]. 中华眼科杂志，2003,39（6）：348-351.[4] 欧阳朝枯，胡文政，褚仁远. 凹透镜对豚鼠眼生长及屈光发展的影响[J]. 眼科研究，2002，20：391-393.[5] 胡文政，褚仁远，张利能. 豚鼠实验性近视眼巩膜羟脯氨酸含量改变[J]. 眼视光学杂志，2001，3（2）：103-104.[6] McBriem NA, Lawlor P, Gentle A. 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