大鼠视皮层神经元原代培养

大鼠视皮层神经元原代培养作者：张荻    作者单位：中南大学湘雅医院 眼科，湖南 长沙 410008    【摘要】  目的 通过原代培养新生大鼠视皮层神经元，探求视皮层神经元的最佳分离和培养方法，提高原代培养神经元的纯度及活性，为视皮层相关性眼病的临床基础研究提供实验模型。方法 分离新生大鼠视皮层神经元，应用含10%新生牛血清、10% F-12 Nutrient Mixtures的DMEM培养基进行接种培养，含2% B-27 Serum-Free Supplements的Neurobasal Medium进行维持培养，利用尼氏染色进行神经元鉴定。结果 培养的神经元生长良好，胞体饱满，突起长。尼氏染色示神经元比例大于50%。结论 采用上述培养方法可以使新生大鼠视皮层神经元得到良好的生长和较高的纯度。    【关键词】  视皮层 神经元 原代培养    神经元的原代培养是进行神经系统结构和功能研究的一种重要手段。通过原代培养，可以并且容易对研究的条件进行人为的控制，并保持相对恒定，进行一些在体内无法实施的研究内容，具有影响因素单一、机体复杂因素干扰少和结果容易分析等优点。视皮层是视觉系统的高级中枢，对弱视等与视皮层相关性眼科疾病的临床基础研究具有重要意义。本实验采用酶消化法分离新生大鼠视皮层神经元，应用含10%新生牛血清、10%F-12 Nutrient Mixtures的DMEM培养基进行接种培养，用含2% B-27 Serum-Free Supplements的Neurobasal Medium进行维持培养，以寻求视皮层神经元的最佳分离和培养方法，提高原代培养神经元的纯度及活性。1  材料与方法    1.1  实验动物及主要试剂  出生后1~3 d清洁级SD大鼠，由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供。DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）、Neurobasal Medium、F-12 Nutrient Mixtures和B-27 Serum-Free Supplements、谷氨酰胺购自美国Gibco公司。多聚赖氨酸、胰蛋白酶购自美国Sigma公司。新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。甲苯胺蓝购自美国Invitrogen公司。青霉素、链霉素为国产。    解剖液由HBSS加入200 U/ml青霉素及链霉素配成。接种培养基由DMEM加入10% F-12 Nutrient Mixtures、10%新生牛血清、0.06 mg/ml谷氨酰胺、200 U/ml青霉素及链霉素配成。维持培养基-1由Neurobasal Medium 加入2% B-27 Serum-Free Supplements、0.06 mg/ml谷氨酰胺、200 U/ml青霉素及链霉素构成。维持培养基-2由Neurobasal Medium 加入2% B-27 Serum-Free Supplements、200 U/ml青霉素及链霉素构成。上述溶液过滤除菌后于4℃保存备用。    1.2  视皮层神经元分离及培养  实验前一天，于每只培养瓶中置入14~15片8 mm×8 mm大小盖玻片，再加入适量0.05 mg/ml多聚赖氨酸，以能盖住瓶底为限。将培养瓶放入37℃恒温培养箱中过夜。第2天取出后吸除多余的多聚赖氨酸，加入少许接种培养基洗涤一次，吸净备用。    乳鼠经75％乙醇消毒5 min后迅速断头处死，沿矢状线剪开、剥除头皮及颅骨，用解剖镊将大脑及小脑完整取出，置入一盛有4℃无菌解剖液的培养皿中。于体视显微镜下剥离软脑膜。视皮层位于大脑枕区背侧面，约2 mm×3 mm大小，如图１虚线部分所示。用锋利手术刀片切除相应区域，深度约2~  3 mm，皮层组织用刀片尖端小心挑出[1]。将取得的皮层组织用显微剪剪碎成1 mm3大小的小块，加入0.125%胰蛋白酶，置于37℃恒温箱消化15 min。加入含10%小牛血清的接种培养基终止消化。反复吹打组织块使之变成单细胞悬液，静置后取中上层悬液接种于事先铺有多聚赖氨酸的培养瓶中，加入适量接种培养基，调整细胞密度至2×104~4×104个/cm2。置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。24 h后用维持培养基-1换液1次。第3天开始用维持培养基-2以1~2 d的1/3量换液一次。    每天用倒置显微镜对培养细胞的生长状态及形态学变化进行观察。    1.3  神经元鉴定  用1%甲苯胺蓝做尼氏染色鉴别神经元与非神经元细胞。具体方法如下：用4%多聚甲醛固定细胞爬片20 min。双蒸水洗爬片3次，每次3 min。滴加1%甲苯胺蓝溶液后置于54℃恒温箱内浸染30~40 min。冷却后用自来水、双蒸水各洗1次，每次3 min。以95%的乙醇迅速分化。无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在光学显微镜下观察并记录：在高倍视野下，随机取10个视野，计数神经元数和细胞总数，计算神经元比例。计算公式为神经元比例=神经元数/细胞总数。2  结果    2.1  培养大鼠视皮层神经元形态特点  接种1 h后大部分细胞已贴壁。2~3 h后可见少数细胞长出较短的突起。培养24 h后，长出突起的神经元数目进一步增多，突起长度增加，约为自身胞体长度的 1/2至1~2倍。健康的神经元应是透亮的，胞体饱满、内无明显颗粒，通常较容易观察到细胞核及核仁。胞体多呈多边形和三角形，周围有不同程度的光晕。神经元周围可见较多非神经元细胞。培养第3天的神经元生长良好，突起进一步增多、长长。培养  6 d以后可见非神经元细胞逐渐减少。培养10 d以后神经元仍生长良好，未见明显崩解死亡迹象，突起长度可达自身胞体直径的10倍以上，并形成复杂的网络结构（见图2）。    2.2  神经元鉴定  培养12 d后，大鼠视皮层神经元经尼氏染色后胞浆呈蓝紫色，尼氏小体呈颗粒状，结构清晰。非神经元细胞胞浆基本不着色，胞核呈淡紫色圆形，核仁清晰可辨（见图3）。神经元比例可达50%以上。3  讨论    视皮层是视觉系统的高级中枢，对弱视等与视皮层相关性眼科疾病的临床基础研究具有重要意义。通过对视皮层准确定位及原代培养，可以并且容易对研究的条件进行人为的控制，并保持相对恒定，进行一些在体内无法实施的研究内容。早在1991年Banker等[1]就在神经元培养的经典著作《Culturing Nerve Cells》中以视皮层为例较为详细地介绍了新生大鼠大脑皮层神经元的培养方法，这种方法在随后的眼科研究中得到了较为广泛的应用[2]。本实验视皮层的取材方法即参考此书，取得的组织主要为初级视皮层组织。    神经元体外培养的成活率受许多因素的影响。一般来说，取材动物的年龄越小，成活率越高。多数培养的神经元取自胚胎动物，这主要是因为此时神经元的分离培养是在轴突和树突广泛分支发育之前，神经元不易在分离过程中受到损伤。并且在发育的早期阶段，神经元对靶细胞营养的依赖性较低，脑膜和结缔组织鞘膜也易于分离干净[3]。本实验视皮层取自新生大鼠而不是胎鼠也有其优点，例如节省动物，取材方便，鼠龄明确。且出生后大鼠中枢神经系统的神经元已经具有许多成熟的性质和特征，也已经能够较明确地辨别其各个解剖区域，所获得的组织定位更为可靠。    目前，神经元的体外培养应用最多的是含血清的DMEM基础培养基，但由于多数培养基是根据非神经元的连续增殖营养所需而设计的，对神经元生长不大合适。并且在神经组织的分离细胞悬液中，一些非神经元细胞是无法完全去除的，包括神经胶质细胞、脑脊膜细胞以及成纤维细胞等[4]。由于这些细胞在体外能广泛增殖，所以在神经元的长期培养中一般要加入一定量的有丝分裂抑制剂如阿糖胞苷等以防止其过度增长[5]。而阿糖胞苷对神经元也有一定的毒性作用，可导致神经元的死亡。综合以上原因，我们在神经元培养的早期采用含新生牛血清、F-12 Nutrient Mixtures、谷氨酰胺的DMEM作为接种培养基。血清中既含有纤连蛋白、层黏连蛋白等介导细胞贴壁的因子，又含有多种营养物质，在加入了F-12 Nutrient Mixtures、谷氨酰胺等添加剂后营养更为全面，能够帮助神经元贴壁，并为其贴壁提供充足的能量。待细胞稳定贴壁后再将培养基逐渐过渡为Neurobasal Medium/B-27 Serum-Free Supplements无血清培养基进行维持培养。无血清培养基可以抑制非神经细胞的生长，尤其是成纤维细胞明显减少；神经细胞突起分化早、伸展快[6]。维持培养基专为培养神经元而设计，能够满足神经元的特殊营养需求，而胶质细胞等在其中不能够持续分裂增殖而逐渐死亡，因此能够纯化神经元。我们使用上述培养基培养的神经元状态良好，密度较高，非神经细胞数量不多，不添加阿糖胞苷也能够获得较高纯度的神经元。    总之，我们对大鼠视皮层神经元原代培养在取材部位、时间的控制以及培养基的配制等方面进行了改进，不但可得到较高纯度的神经元，而且可使神经元生长的质量和数量达到比较理想的状态，满足实验的需要。【参考文献】[1] Banker G, Goslin K. Culturing Nerve Cells[M]. Cambridge：The MIT Press，1991：227-249.[2] XueTao B, Margaret TT, Wong R. Neuronal activity regulates protein and gene expressions of GluR2 in postnatal rat visual cortical neurons in culture[J]. J Neurocytol，2003,32(2):71-78.[3] 郑志竑，林玲. 神经细胞培养理论与实践[M]. 北京:科学出版社，2002：77.[4] Graham JM. Isolation of rat and human hippocampal neuron fractions in a discontinuous density gradient[J]. Scientific World Journal，2002，2(6):1634-1637.[5] Berg DK, Fischbach GD. Enrichment of spinal cord cell cultures with motoneurons[J]. J Cell Biol，1978,77(4):83-98.