人眼基底部玻璃体视网膜界面超微结构的研究

作者：杨丽霞 王静 作者单位：山东大学第二医院眼科, 济南 250033  【摘要】  目的 通过对不同年龄人眼基底部玻璃体视网膜界面超微结构的研究, 探讨基底部玻璃体视网膜界面年龄相关性变化。方法 采用胰蛋白酶消化法去除11只眼库眼球基底部视网膜的细胞成分，暴露视网膜内界膜（inner limiting lamina, ILL），扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观测其超微结构。结果 SEM和TEM均显示，基底部ILL表面的胶原纤维束随年龄增长逐渐向ILL侵入。胶原纤维开始以发辫形式散布在ILL表面，纤维发辫逐渐散开、相互重叠，穿透ILL与玻璃体皮质纤维交织结合在一起，最终形成致密的网状结构。结论 随年龄增长来自视网膜内的胶原纤维逐渐穿透ILL与玻璃体皮质纤维缠绕结合，使基底部玻璃体视网膜界面粘连延伸。

【关键词】  基底部 玻璃体视网膜界面 显微镜检查 电子

    YANG Lixia, WANG Jing

    (Department of Ophthalmology, Second Hospital of Shandong University, Jinan 250033,  China)

    Abstract: Objective  To evaluate the ultrastructures of the basal vitreoretinal interface in human eyes of different ages. Method  The cellular elements were removed from the retinal surface after trypsin digestion in 11 donor eyes, and the retinal part of the inner limiting lamina (ILL) was examined by scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM). Results   Both SEM and TEM showed a progressive insertion of the basal superficial retina by bundles of collagen fibrils, which splayed out beneath the ILL in the young and finally formed a dense network in the elderly. Conclusion  The intraretinal collagen fibrils penetrating the ILL and mixing with the cortical vitreous fibrils appears to underlie the slow adhesion of the vitreoretinal interface with aging.

    Key words:  Vitreous base; Vitreoretinal interface; Microscopy, electron    基底部玻璃体视网膜界面是锯齿缘后玻璃体与视网膜紧密粘连部位，即使在病理改变或受到严重外伤时，仍不能分离。基底部玻璃体视网膜界面的特性具有重要的临床意义［1］。由眼外伤或眼球转动引起玻璃体基底部的牵拉，可导致基底部后界视网膜撕裂；玻璃体/白内障手术时，从基底部附近进出器械或切除玻璃体时牵拉基底部，可造成视网膜裂孔和视网膜脱离的形成。本研究采用眼库眼球，胰蛋白酶消化法去除视网膜细胞成分，暴露基底部玻璃体视网膜界面的表面结构；运用扫描电镜(SEM)、透射电镜技术(TEM)对其超微结构及年龄相关性变化进行观察，探讨在视网膜撕裂、视网膜脱离和玻璃体后脱离等常见致盲眼病形成中的作用机制。

    1  资料与方法

    1.1  临床资料  11只眼库眼球，来自山东大学第二医院移植中心和济南市眼科医院。取除角膜用于移植，剩余部分保存在4?℃生理盐水中，制备成研究所用的标本。供者年龄27 76岁（平均55岁），男9例，女2例，供者眼部疾病的情况不详。

    1.2  标本制作方法  将虹膜和晶体去除后，行开窗式玻璃体切除术清除中央部玻璃体，将残留的玻璃体皮质和视网膜从脉络膜及巩膜上剥离，将锯齿缘后约5?mm宽的玻璃体基底部和与之粘连的前部视网膜充分展平，制成4?mm2×4?mm2的标本。

    1.3  胰蛋白酶消化  制作完成的标本用PBS漂洗2次，每次5?min；3%胰蛋白酶Tris缓冲液（0.1?mol/L，pH7.8）37?℃恒温水浴30?min；PBS漂洗3次，每次5?min。

    1.4  SEM标本制作  经胰蛋白酶消化后的标本，用2%戊二醛磷酸缓冲液初固定24?h，PBS漂洗；1%锇酸后固定2?h；10% 100%乙醇梯度脱水，每次20?min；临界点干燥；镀金；Cambridge 360扫描电镜观察、照相。

    1.5  TEM标本制作  经胰蛋白酶消化后的标本，用2%戊二醛磷酸缓冲液初固定24?h；1%锇酸后固定2?h；10% 100%乙醇梯度脱水，每次20?min；Epon 812包埋，超薄切片；醋酸双氧铀及枸橼酸铅电子染色，JEM 1200EX透射电镜观察、照相。

    2  结  果

    2.1  SEM观察结果  经胰蛋白酶消化后的基底部玻璃体视网膜界面（ILL）无残留细胞成分。在年轻的眼ILL表面可见胶原纤维“发辫”（见图1）；随年龄增长，这些纤维“发辫”逐渐散开、伸展、相互重叠，并穿透ILL与玻璃体皮质纤维交错、编织在一起（见图2）；最终在ILL表面形成致密的胶原纤维网状结构(见图3)。

    ILL表面的胶原纤维“发辫”，ILL破损处可见玻璃体皮质纤维（cortical vitreous, CV）。放大倍数（magnification，MAG）MAG=×3.85?K（27岁，男性）

    Fig.1  A collagenous braid was shown and the fibril bundles of the cortical vitreous (CV) were visible in the depths of an artificial split in the ILL. MAG=×3.85?K (male, aged 27 years).胶原纤维“发辫”展开、相互重叠，穿透 ILL (箭头示)与玻璃体皮质纤维(CV)交织在一起。MAG=×9.04?K（58岁，男性）

    Fig.2  Overlapping skeins penetrate through a break in the ILL (arrows) and mix with fibril bundles of the basal vitreous cortex. MAG=×9.04?K (male, aged 58 years)

    胶原纤维在ILL表面形成致密的纤维网状结构。MAG=×3.40?K（74岁，女性）

    Fig.3  A dense network of fibril bundles is beneath the ILL. MAG=×3.40?K (female, aged 74 years)

    2.2  TEM观察结果  来自视网膜侧的胶原纤维穿透ILL破损处，嵌入玻璃体皮质纤维而形成基底位于玻璃体内的“巢穴”，ILL断面边缘均指向玻璃体方向（见图4）。SEM观测结果显示胰蛋白酶消化后的视网膜侧内界膜（ILL）表面呈无细胞形态。

TEM显示视网膜侧的纤维穿透ILL破损处，嵌入玻璃体纤维形成基底位于玻璃体内的“巢穴”（黑色箭头示），ILL断端（白色箭头示）指向玻璃体方向。 MAG=×3.00?K（72岁，男性）

    3  讨  论

    基底部玻璃体视网膜界面由玻璃体胶原纤维、ILL和Müller细胞的脚板组成［2］。该处玻璃体胶原纤维垂直嵌入ILL，形成紧密连接。研究表明儿童玻璃体皮质与视网膜的分离（posterior vitreous detachment, PVD）可一直延伸至锯齿缘；而成年人PVD则被周边部玻璃体视网膜形成的紧密粘连所阻止［3］。Foos等［4］用TEM从切面观测玻璃体视网膜界面的结构，发现ILL存在破损部位，并有玻璃体胶原纤维嵌入，从而形成基底部玻璃体视网膜的致密粘连。以上研究证明基底部玻璃体视网膜界面的结构随年龄发生了一系列组织学改变，玻璃体胶原纤维与ILL在此过程中进行“重塑"并逐渐形成多层致密连接，但发生机制尚不清楚。

    本研究采用胰蛋白酶消化法去除视网膜细胞成分，暴露基底部玻璃体视网膜界面（视网膜侧ILL）的表面结构，通过SEM观察发现无细胞成分的ILL表面，随年龄增长逐渐呈现“胶原纤维化”的改变，视网膜侧的胶原纤维从开始时的纤维“发辫”逐渐伸展、散开、重叠，最终穿透ILL与玻璃体皮质纤维相互交错、编织形成致密的纤维网状结构。TEM结果发现，视网膜侧的胶原纤维穿透ILL嵌入玻璃体内，并与玻璃体纤维相互交织，在玻璃体内形成与玻璃体胶原纤维方向垂直的新的胶原纤维“巢穴”（见图4）。Foos等［5］通过TEM也发现基底部ILL出现破损，相应处视网膜表层细胞周围出现胶原纤维形成的空隙。推测为缺血或某些生物动力学因素导致周边部视网膜发生退行性改变，即“退行性重塑”，导致ILL破损，玻璃体胶原纤维插入视网膜表层细胞间而形成空隙。本研究结果表明，这种胶原纤维穿透ILL导致玻璃体视网膜界面结构重塑的过程，其新生的胶原纤维来自视网膜内或在视网膜内形成，而并非如Foos推测的那样来自玻璃体。TEM结果显示ILL破损处断端均指向玻璃体，即眼球中心方向（见图4）。有研究表明，在ILL破损处出现的新胶原纤维来自视网膜内［6］，与本研究结果一致。另外，最近对体外培养的人视网膜Müller细胞吞噬作用的研究表明，视网膜的细胞在玻璃体视网膜界面年龄相关性的“重塑”过程中发挥着重要作用［7］。

    本研究结果表明，基底部玻璃体视网膜界面随年龄增长发生“重塑”的过程，是玻璃体胶原纤维和视网膜ILL相互“重塑”的过程，既有ILL的破损，也有视网膜内新胶原纤维的合成，最终形成基底部玻璃体视网膜紧密粘连。此结构特性是PVD形成后由于玻璃体的牵拉，导致基底部发生视网膜撕裂和视网膜脱离的主要危险因素，但新胶原纤维穿透ILL和视网膜内合成的机制还有待继续研究。

【参考文献】  ［1］ Sebag J. Anomalous posterior vitreous detachment: a unifying concept in vitreoretinal disease［J］. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol， 2004， 242(8):690698.

［2］ Heegaard S. Morphology of the vitreoretinal border region［J］. Acta Ophthalmol Scand Suppl， 1997， 222(Suppl 1):131.

［3］ Lindner K. The vitreous: its pathologic histology and examination with the slit lamp［J］. Arch Ophthalmol， 1950， 43:578.

［4］ Foos R F, Wheerler N C. Vitreoretinal juncture: synchysis senilis and posterior vitreous detachment［J］. Ophthalmology， 1982， 89（12）:15021512.

［5］ Foos R Y. Anatomic and pathologic aspects of the vitreous body［J］. Trans Am Acad Ophthalmol Otolargngol， 1973， 77（2）:171183.

［6］ Ponsioen T L, van der Worp R J, van Luyn M J, et al. Packages of vitreous collagen (type II) in the human retina:an indication of postnatal turnover［J］. Exper Eye Research， 2005， 80（5）:643650.