KH902抑制猴激光致脉络膜新生血管

作者：夏庆杰,张明,吴苹,张发强

作者单位： 1 610041 四川成都，四川大学华西医院肿瘤生物治疗实验室(*眼科，**国家中药安全评价中心)

                2 四川成都，成都康弘生物科技有限公司（△通讯作者）【关键词】  复明肽；脉络膜新生血管；血管内皮细胞生长因子

      ［摘要］   目的   血管内皮细胞生长因子（VEGF）在视网膜新生血管发生中起着核心而关键的作用。有证据表明，VEGF在老年黄斑变性（AMD）的脉络膜新生血管发生中也是一个重要的刺激因子。复明肽（KH902）是成都康弘生物科技有限公司提供的人源化的抗体样VEGF捕获蛋白，与VEGF有着较高亲和力，因此被认为能够抑制新生血管的形成。本研究的目的在于观察通过玻璃体腔注射KH902，是否能够有效抑制激光致恒河猴脉络膜新生血管的产生和生成。方法   采用VISULAS532S固体激光器以240 mW，50 ms进行激光眼底照射恒河猴双眼Bruch膜和覆盖其眼上的视网膜色素上皮，击穿Bruch膜，每眼烧出5~9个直径约50 μm损伤点。然后经玻璃体内注射复明肽（640 μg/眼；n=4眼/组）或等体积PBS，每周注射1次。3周后行眼底血管荧光造影，观察并记录激光斑荧光渗漏情况并采用SPSS10.0软件进行统计学分析。结果   在注射PBS的对照组，有48%（12/25，4眼）的激光损伤斑出现强荧光渗漏，而复明肽给药组，仅有8%（2/24，4眼）的激光损伤斑发现有荧光渗漏，且有渗漏非常轻微，未发现强荧光渗漏，两组差异具有显著性（P＜0.05）。结论   该研究显示，复明肽（KH902）具有强烈抑制激光致恒河猴脉络膜新生血管的作用，提示其在治疗新生血管性AMD的方面具有很好的临床应用前景。

    ［关键词］   复明肽；脉络膜新生血管；血管内皮细胞生长因子

      Fumintide suppresses choroidal neovascularization in laser injury cynomolgus monkeys

    XIA Qingjie，ZHANG Ming，WU Ping，et al.Laboratory of Biotherapy of Cancer，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China

    ［Abstract］   Objective   Vascular endothelial growth factor (VEGF) plays a central role in the development of retinal neovascularization and diabetic macular edema. There is also evidence suggesting that VEGF is an important stimulator for choroidal neovascularization in aged macular degeneration (AMD). Fumintide (Kanghong Co. Chengdu， P. R. China) is a humanized antibodyliked molecule designed to bind VEGF. This protein was suggested to supress the neovascularizations. To study the efficacy of intravitreal injections of fumintide on experimental choroidal neovascularization in the cynomolgus monkey eye. Methods   Choroidal neovascularization was induced by laser in jury as 5~7 ruptures per eye of Bruchs membrane in both eyes of cynomolgus monkeys and followed with weekly intravitreal injections of fumintide(640 μg/eye; n=4/group) or PBS. Photography and fluorescein angiography were carried out three weeks later. Fluorescein angiograms were graded using a masked standardized

    夏庆杰，男，副研究员，1966年7月出生于山东省聊城市。1997年7月毕业于华西医科大学医学院，医学遗传学专业，方向为医学分子及细胞遗传学，理学博士学位。1995年起，主要从事精子发生过程中特异表达基因的克隆工作，熟练掌握了现代分子生物学研究技术，并发明了可以体外复制任意DNA片段的UT-PCR技术，为克隆未知序列的新基因提供了简便有效的方法。1998年以来获自然科学基金面上课题“脆性X综合征快速基因诊断及其新技术探索”，负责项目设计和组织实施。现已基本完成课题研究工作，发表相关论文两篇并申请相关国家发明专利3个。同时还获得四川省计划生育委员会科研课题和华西医大科研课题各1项。还作为主研人员参加了国家自然科学重大项目、973项目、863项目各1项。并于2000年当选为成都市青年科技之星。2000年3月以来，主要从事分子生物学新技术探索包括基因表达分析，转基因及基因功能鉴定和基因诊断研究工作，具体为靶基因筛选、引物探针设计、核酸分子杂交动力学及杂交条件优化、芯片杂交新技术、实时荧光定量PCR检测技术应用和改进等研究等工作，承担各类科研课题7项，发表学术论文20余篇。

    protocol. The data were analyzed with SPSS10.0. Results   In the intravitreal injections of PBS control group， strong fluoroscein leakage was seen in 48% laser injury spot (12/25，4 eyes)， but in the fumintide treated group， the ratio decreased significantly to 8.3%(2/24，4 eyes)（P＜0.05). Conclusion   This study demonstrates that fumintide has a strong supression on choroidal neovascularization and profiles its clinical use in treating neovascular AMD.

    ［Key words］   Fumintide;choroidal neovascularization;vascular endothelial

    脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV），是指产生于视网膜下脉络膜上的不正常血管，并由于其结构缺陷能渗漏血浆和血液，导致瘢痕组织的生成，从而破坏视网膜功能，尤其是位于黄斑区的新生血管，破坏了中心视力，是导致患者失明的主要原因之一［1］。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）是刺激形成新生血管的主要因子之一，在视网膜和脉络膜新生血管发生中起着核心而关键的作用［2~4］。尽管临床上已经开展了激光治疗、手术治疗、放射治疗及药物治疗等多种治疗新生血管的治疗技术，但效果并不理想［5~7］。近年来，抗新生血管药物的研究非常活跃，理论上任何灭活VEGF或降低VEGF作用的药物都具有抑制新生血管形成的作用［8，9］。复明肽（Fumintide， KH902）是通过基因工程手段，融合人血管内皮细胞生长因子受体FLT-1和KDR的特定结构域及人lgG  Fc片段而形成的重组人源化融合蛋白，能与VEGF高亲和力结合，从而阻止VEGF与其内皮细胞表面的受体结合，阻断其生物活性，理论上能够抑制内皮细胞增殖和新生血管生成。为了探明复明肽是否具有抑制新生血管生成的作用，为该药进一步的临床应用提供动物实验依据，我们采用恒河猴激光致脉络膜新生血管模型，进行了复明肽抑制新生血管作用的实验，现介绍如下。

1   材料与方法

    1.1   实验材料

    1.1.1   实验药品   玻璃体注射用复明肽，批号：20041001，16 mg/支，纯度＞95%，2 ℃~

    8 ℃保存，有效期2年。由成都康弘生物科技有限公司提供。配制方法：临用时，从冰箱中取出，自然解冻后使用。

    1.1.2   实验动物   普通级成年健康恒河猴4只，雌雄各半，体重3.0~5.0 kg，成都平安动物繁育研究基地引进。入室前1周接受结核菌素、寄生虫、沙门菌、致贺菌检查，合格后引入。恒河猴饲养于国家成都中药安全性评价中心，普通动物房，实验前动物适应环境并进行驱虫治疗，检测体温，并接受血液学、血清生化、电解质、粪尿液和心电图检查2次。选择健康（雌性须未孕）动物作为受试动物，不锈钢猴笼分笼饲养，饲养条件符合国标GB14925-2001标准，室温（21±5）℃，相对湿度（55±15）%，12 h明暗交替。猴用全价营养颗粒饲料喂养，去离子水装瓶自由饮用，每日添加水果。

    1.2   实验方法

    1.2.1   动物造模   将4只恒河猴，随机分为PBS对照组和复明肽实验组2组，每组2只。3%戊巴比妥静脉注射麻醉后，美多丽（日本参天制药株式会社）滴眼散瞳，VISULAS 532S固体激光器以240 mW，50 ms进行激光眼底照射Bruch膜和覆盖其上的视网膜色素上皮，击穿Bruch膜，烧出至少5~9个直径约50 μm损伤点。

    1.2.2   给药剂量与方法   通过玻璃体内注射药物，给药剂量及时间（见表1）为：实验组2只，4眼，共24个激光斑，激光照射后当天给予剂量为640 μg/眼，以后每周1次；第三组2只，4眼，激光照射后14天给予等体积的PBS安慰剂/眼，以后每2周1次。

    1.2.3   结果判定与统计学分析   观察统计：造模后20天做1次荧光素血管造影术，计算造影后10 min左右时荧光素渗漏产生强荧光斑的数目和范围，以评估脉络膜血管新生的病变情形，并进行统计学分析。表1   动物分组及给药表表2   恒河猴激光造模及给药后激光损伤斑部渗漏荧光斑数目 注：实验组与对照组比较，*P＜0.05，差异具有显著性

    2   结果

    动物在给药期及恢复期间自主活动正常，精神状况良好，皮肤被毛清洁，均未观察到明显异常反应。药效学结果：恒河猴经激光造模、玻璃体内注射药物及眼底荧光造影显示给药组较造模安慰剂组荧光渗漏激光损伤斑数目显著性减少，且在激光损伤斑部荧光渗漏也较给予安慰剂组明显减少，差异具有显著性（见表2），在注射PBS的对照组，有48%（12/25，4眼）的激光损伤斑出现强荧光渗漏，而复明肽给药组仅有8%（2/23，4眼）的激光损伤斑发现有荧光渗漏，且渗漏非常轻微，未发现强荧光渗漏（见图1）。两组差异具有显著性（P＜0.05）。见表2。     

    3   讨论

    脉络膜新生血管（CNV）是多种眼底疾病引起视力障碍的重要原因之一，黄斑部位的脉络膜新生血管是一种严重的致盲疾病，是年龄相关性黄斑病变（AMD）的重要病因。由于新生血管的结构缺陷而导致血浆渗漏，使患者视力在短期（几个星期至几个月）内急速下降。我们的恒河猴经激光击穿黄斑区Bruch膜，使其产生新生血管的造模，很好地模拟了脉络膜新生血管的产生，有近1/2的激光损伤斑（48%，12/25）发生新生血管和荧光渗漏。

    在新生血管发生和脉络膜新生血管发生渗漏的过程中，VEGF起到了关键作用。因为VEGF在机体内有两大主要生物学功能：（1）特异地作用于血管内皮细胞，刺激其增殖及移行，诱发新生血管形成；（2）增加血管通透性［3，4］。目前临床上多采用高能激光封闭异常血管的‘光动力疗法’，可以在临床上防止视力进一步下降，但通常不能令病人失去的视力明显回复。通过结合VEGF，拮抗其生物活性的抗新生血管的药物如Avastin有可能在CNV的治疗中取得好的效果。香港中文大学自2005年11月起使用玻璃体内注射Avastin治疗湿性AMD和高度近视引致的CNV，不仅使病人的血管新生得到控制，更使其中多人取得以往使用其他方法所不能做到的视力改善效果。通过玻璃体内药物注射对抗VEGF，如VEGF抑制剂Pagaptanib可以起到抗感染、抑制血管形成、抗血管渗漏的效果，在老年黄斑变性的治疗应用中，它可以作用于任何类型的CNV，减少视力降低的几率，尤其是术后1年效果更为显著［10］。VEGF的单克隆抗体Ranibizumab，无论单独使用或联合治疗，都有着抗血管渗漏的作用［11］。

    复明肽由于其极强的VEGF结合能力和类抗体的血清学性质，在我们的实验中表现出了优良的抗脉络膜新生血管及其渗漏的作用，再由于用药的局部性，令这种治疗方法有可能成为治疗黄斑病变的一个新方向。

       ［参考文献］

    1    朱洁，王雨生，惠延年.脉络膜新生血管的生成和抑制.眼科新进展，2004，24：57-60.

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    3   Veikkola T， alitalo K. VEGFs receptors and angiogenesis. Cancer Biology，1999，9:211-220.

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    5   汪浩，王文吉.脉络膜新生血管的治疗进展.国外医学?眼科分册，2001，25：288-295.

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    7   Sisak S， Scutaru AM， Cormos D， et al. Treatment of choroidal neovascular membranes. Oftalmologia，2005，49(2):90-103.

 8   Yoshitsugu Saishin， Yumiko Saishin. VEGFTRAPR1R2 suppresses choroidal neovascularization and VEGFInduced breakdown of the BloodRetinal barrier. J Cellular Phys，2003，195:241-248.

    9   Seo MS， Kwak N， Ozaki H， et al. Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor. Am J Pathol，1999，154:1743-1753.

    10   Gragoudas ES， Adamis AP， Cunningham ET， et al. VEGF inhibition study in ocular neovascularization clinical trial group. Pegaptanib for neovascular age related macular degeneration. N Engl J Med，2004，351:2805-2816.

    11   Husain D， Kim I， Gauthier D， et al. Safety and efficacy of intravitreal injection of ranibizumab in combination with verteporfin PDT on experimental choroidal neovascularization in the monkey. Arch Ophthalmol，2005，123:509-516.