密蒙花提取物滴眼剂对实验性干眼症鼠泪腺组织细胞凋亡的影响

作者              单位

彭清华      (410007)中国湖南省长沙市，湖南中医药大学第一附属医院眼科学重点学科

姚小磊      (410007)中国湖南省长沙市，湖南中医药大学第一附属医院眼科学重点学科

彭  俊      (410007)中国湖南省长沙市，湖南中医药大学第一附属医院眼科学重点学科

吴权龙      (421001)中国湖南省衡阳市，南华大学医学院

谭涵宇      (421001)中国湖南省衡阳市，南华大学医学院

张菁蓉      (421001)中国湖南省衡阳市，南华大学医学院

0引言

干眼症可导致视力明显下降,发病率很高，已成为目前研究的热点问题。雄激素水平下降是干眼症的重要发病原因，雄激素替代疗法是治疗雄激素水平下降所致干眼症唯一的对因治疗方法，但是长期使用将会带来许多难以避免的副作用。现有其他治疗方法均存在着一定的缺陷和局限性。密蒙花有效部位为黄酮类物质。雄激素和黄酮类化合物均为杂环多酚类化合物，利用其化学结构的相似性，发挥其拟内源性雄激素作用，可治疗雄激素水平下降所致的干眼症。本实验观察密蒙花提取物滴眼剂去势大鼠干眼症模型泪腺组织细胞凋亡的影响。

1材料和方法

1.1材料

取健康1月龄Wistar雄性大鼠45只，体质量0.2kg，由湖南中医药大学动物实验中心提供。裂隙灯显微镜和眼底镜检查眼前节及眼底无异常，地卡因眼液表面麻醉后Schirmer Ⅰ试验(SⅠt)≥10mm/5min,泪膜破裂时间(BUT)≥10s。密蒙花提取物滴眼剂由湖南中医药大学第一附属医院药剂科制备。50g/L BSA封闭液，鼠抗鼠Bax和Bcl2多抗，生物素化山羊抗兔IgG(FITCIgG)，过氧化物酶标记链酶白卵素(strept avidinbiotin complex，SABC)免疫组织化学试剂盒，3，3二氨基联苯胺(3，3diaminobenzidine，DAB)显色剂购自武汉博士德生物工程有限公司。Waters15252996高效液相色谱仪(美国Waters公司，含2996二极管阵列检测器、1525泵、717自动进样器);Empower中文色谱工作站(美国Waters公司);双光束紫外可见分光光度计(北京普新通用仪器有限责任公司);LEICA DM LB2型双目显微镜(德国LEICA公司产);Shandon325型石蜡切片机(英国Shandon公司生产);DNP9162 型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司生产);Motic B5 显微摄像系统(麦克奥迪实业集团公司生产)。

1.2方法

将Wistar雄性大鼠45只，随机分为A1，B1，C1，A2，B2，C2，A3，B3，C3，共9组，每组5只。A：假手术空白组;B：手术对照组;C：密蒙花提取物滴眼剂治疗组;1：饲养1mo;2：饲养2mo;3：饲养3mo。雄激素水平下降导致干眼症动物模型的制作参照马轶群等[1]的方法，行双侧睾丸切除术(ORX)，将B1，B2，B3，C1，C2，C3组实验鼠术前12h禁食水，后肢大腿外侧肌肉碘伏消毒，盐酸氯胺酮注射液30mg/kg ip麻醉，雄鼠取仰卧位，四肢张开并固定，下腹部褪毛剂褪毛，阴囊皮下加用20g/L利多卡因局部麻醉，碘伏消毒，铺无菌巾单，将一侧睾丸由腹腔挤入阴囊并捏紧，勿使其滑动。用消毒刀片将阴囊切一小口，用力挤出睾丸，结扎精索静脉及输精管，切除睾丸及附睾，连续缝合阴囊皮肤后局部涂碘酊预防感染。另侧睾丸及附睾同法切除。A1,A2,A3组只切开阴囊，不切除睾丸，术后连续缝合阴囊皮肤。术前im青霉素针20万U，术后连续3d im青霉素针20万U，预防感染。A1,B1组每日以生理盐水滴眼，ou，tid;C1组每日以密蒙花滴眼剂滴眼，1滴/次，ou，tid;每组均滴眼1mo。以常规饲料喂养1mo后处死。A2,B2组每日以生理盐水滴眼，ou，tid;C2组每日以密蒙花滴眼剂滴眼，1滴/次，ou，tid;每组均滴眼2mo。以常规饲料喂养2mo后处死。A3,B3组每日以生理盐水滴眼，ou，tid;C3组每日以密蒙花滴眼剂滴眼，1滴/次，ou，tid;每组均滴眼3mo。分别于分组前和常规饲料喂养末次给药完成后进行Schirmer Ⅰ试验(SⅠt)和泪膜破裂时间(BUT)检查，检测标准参照SⅠt与BUT的诊断标准。检查完后立即以断头法处死动物，即刻摘除泪腺。予以40g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，每组石蜡块予以Shandon325型石蜡切片机连续切片，常规脱蜡至水，蒸馏水洗涤2min×2次。免疫组化检测严格按照说明书操作。木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察，Motic B5显微摄像系统进行摄像。

统计学分析:用SPSS 13.0软件进行统计学分析，双侧检验，以P<0.05为差异有统计性意义。

2结果

2.1基础泪液分泌量比较

空白组SⅠt测量值比较,经方差分析，A1,A2,A3各组之间均无显著性差异，以及经自身前后配对t检验，各组生理盐水滴眼前后，大鼠SⅠt均无显著性差异。模型组(B1,B2,B3)SⅠt测量值比较：经自身前后配对t检验，雄鼠模型组去势后1,2,3mo后基础泪液分泌量明显减少，滤纸湿长缩短，与去势前有明显差异(P<0.01)，另外经方差分析，与B1组去势1mo后基础泪液分泌量比较，去势2mo和去势3mo的B2,B3组泪腺分泌量要更低(P<0.05，P<0.01)，可见去势后，泪腺的基础分泌量随着时间的增长而降低。治疗组SⅠt测量值比较,雄鼠去势后经密蒙花提取物滴眼剂治疗后，经方差分析，C1,C2,C3各组之间均无显著性差异，以及经自身前后配对t检验，各组滴眼前后，大鼠SⅠt均无显著性差异，表明密蒙花提取物滴眼剂能够较好地维持泪液基础分泌量。治疗后治疗组与模型组(C1与B1,C2与B2,C3与B3)SⅠt测量值比较：以滴眼前的试纸湿长为协变量，经协方差分析，C1,C2,C3组去势后经密蒙花提取物滴眼剂治疗，基础泪液分泌量增加，滤纸湿长与相应的模型组B1,B2,B3组比较增长明显(P<0.01，表1)。表1大鼠各组治疗前后SⅠt测量值(略)

2.2泪膜稳定性比较

大鼠各组BUT测量值见表2。空白组BUT测量值比较，经方差分析，A1，A2，A3各组之间均无显著性差异，以及经自身前后配对t检验，各组生理盐水滴眼前后，大鼠BUT均无显著性差异。模型组(B1，B2，B3)BUT测量值比较，经自身前后配对t检验，雄鼠模型组去势后1，2，3mo后泪膜稳定性明显下降，泪膜破裂时间明显缩短，与去势前有明显差异(P<0.01)，另外经方差分析，与B1组去势1mo后泪膜稳定性比较，去势3mo的B3组的泪膜破裂时间要更低(P< 0.05)，可见去势后，泪膜稳定性随着时间的增长而逐渐呈现降低的趋势。治疗组BUT测量值比较，雄鼠去势后经密蒙花提取物滴眼剂治疗后，经方差分析，C1，C2，C3各组之间BUT测量值均无显著性差异，以及经自身前后配对t检验，各组滴眼前后，大鼠BUT均无显著性差异，表明密蒙花提取物滴眼剂能够较好地维持泪膜稳定性。治疗后治疗组与模型组(C1与B1，C2与B2，C3与B3)BUT测量值比较，以滴眼前的泪膜破裂时间为协变量，经协方差分析，C1，C2，C3组去势后经密蒙花提取物滴眼剂治疗，泪膜稳定性增加，泪膜破裂时间与相应的模型组B1，B2，B3组比增长明显(P<0.01)，另外经方差分析，与C1组去势治疗1mo后泪膜稳定性比较，去势治疗3mo的C3组的泪膜破裂时间要相对较低(P< 0.05)，可见去势后，密蒙花提取物滴眼剂维持泪膜稳定性的能力，随着时间的增长而逐渐呈现降低的趋势。表2大鼠各组治疗前后BUT测量值(略) 表3各组治疗后Bax和Bcl2表达及细胞凋亡数的变化(略)

2.3泪腺细胞凋亡比较

各组细胞凋亡数量的比较：模型组(B1,B2,B3组)去势后1,2,3mo后细胞凋亡明显增强，泪腺腺泡和导管上皮中均可见散在的阳性凋亡细胞，平均每高倍视野45.4±9.3和58.2±10.3和70.4±11.7)个，经方差分析，与相应空白组(A1，A2，A3组)比较有明显差异(P<0.01);另外经方差分析，与B1组比较，B3组的细胞凋亡数量要更多(P<0.05)。光镜下可见凋亡细胞核呈棕黄色，有的细胞核中染色物质集中于核膜下呈不规则环形或半月形，有的可见分裂的细胞核。C1，C2，C3组去势后经密蒙花提取物滴眼剂治疗1，2，3mo，细胞凋亡缓解，C1，C2，C3组平均每高倍视野12.8±7.9和21.3±8.9和31.9±6.7)个，经方差分析，与相应模型组(B1，B2，B3组)比较有明显差异(P<0.01,表3)。凋亡相关基因蛋白Bax及Bcl2的表达：采用电子计算机图像分析技术检测各组泪腺细胞Bax及Bcl2染色的平均吸光度值。大鼠各组治疗后Bax和Bcl2平均吸光度测量值见表3。结果表明空白组(A1，A2，A3)Bax及Bcl2的表达均不明显。模型组(B1，B2，B3)去势后1，2，3mo，均可见Bax大量表达于细胞膜和细胞质中，呈棕黄色颗粒，而Bcl2表达不明显。治疗组(C1，C2，C3)经密蒙花提取物滴眼剂治疗后，Bcl2表达增强，可见其大量表达于细胞膜和细胞质中，呈棕黄色颗粒，Bax表达较相应模型组减弱。

3讨论

干眼症暂无确切的中医病名，根据其症状，轻症可归属于“白涩症”，重症可归属于“神水将枯”、“外障翳症”的范畴。而雄激素水平下降所致干眼症常属于重症干眼症，应归属于“神水将枯”的范畴，“外障翳症”则是其病程转归的不良结果。《秘传眼科龙木论》论：“目涩者何也?答曰：此乃熏脏腑也。……液道枯干，脏腑邪热传于卫，真气不荣于目，故目涩也。”可见 “神水将枯”病理机制为内因在脏腑之邪热伤阴液，邪热传于卫表则为风热。而《素问·宣明五气篇》说：“五脏化液，肝为泪”，《银海精微》说：“泪乃肝之液”，可见“神水将枯”所病脏腑在肝，所以治疗原则应该在内清肝热、养肝阴，在外清卫表风热。密蒙花既能清肝，又能养肝，为厥阴肝经之正药[2]。《银海精微·药性论》曰：“密蒙花，……，入肝经，能明目。”所收录代表方剂为密蒙花散，以密蒙花为君药。《银海精微·卷之下》说：“密蒙花散：治久患内外障翳，羞明怕日，……风热气障等病皆治之。”《秘传眼科龙木论》有其治疗眼表干燥的论述：“密蒙花散：治风气攻注，两眼昏暗，眵多羞明。睑生风栗，隐涩难开，或痒或痛，……昏涩隐疼，并暴赤肿疼皆治之。”可见密蒙花在内可清肝之积热，滋肝之阴液，在外清卫表风热，恰中干眼症中医病因病机，拥有中医理论依据，为治疗干眼症的理想药物，成为其治疗干眼症的一大优势。

3.1密蒙花提取物治疗干眼症的可能机制

雄激素、黄酮均为杂环多酚类化合物，可以利用其化学结构的相似性，与AR结合。目前研究已证明某些黄酮类化合物具有拟雄激素作用[3]，可以用于治疗因雄激素水平下降所致的某些疾病[4]。利用放射性示踪标记的方法研究还表明黄酮是细胞AR的刺激物，可以与细胞AR结合发挥生物学效应[5]。已有研究证明在密蒙花花蕾中可分离得到8个黄酮类化合物，密蒙花中所含黄酮也应可与AR结合，产生拟雄激素效应，治疗雄激素水平下降导致的疾病，自然也可包括干眼症，其可能在治疗性激素水平下降导致干眼症方面起到独到的效果[610]。符合干眼症西医病因病理，拥有西医理论依据。密蒙花所含黄酮可作为治疗干眼症理想的雄激素替代药物，成为其治疗干眼症的另一大优势。

3.2密蒙花提取物对泪腺局部细胞凋亡的影响

细胞凋亡在免疫性疾病中起到十分重要的作用。已有研究表明正常结膜上皮和泪腺极少发生细胞凋亡现象[11]，而在干眼症患者和KCS的动物模型中发现结膜上皮细胞和泪腺腺泡细胞的凋亡增加[11，12]。Toda等[13]发现，MRL/lpr雌鼠泪腺中bcl2，cmyb，cmyc，P53及AR mRNA均显著高于雄鼠。应用雄激素后，除使腺体中淋巴细胞浸润程度明显减轻的同时，泪腺中的Bax mRNA也明显减少，而bcl2，cmyb及AR mRNA都明显增加。Toda等[11]研究还发现，免疫性动物和非免疫性动物中雄激素水平与泪腺组织中bcl2，cmyb的mRNA的含量有关，因此这可能是女性易患干眼症的原因之一，但其具体调控机制尚不清楚。另外，Azzarolo等[14]还发现，雄激素有防止泪腺细胞凋亡，坏死和淋巴细胞浸润的作用。这说明雄激素水平高低与干眼症的泪腺细胞凋亡和炎症之间有密切的关系。本实验研究表明，通过密蒙花提取物滴眼剂的干预，抑制了细胞凋亡，表现为C1，C2，C3组泪腺组织中Bcl2表达显著提高，而Bax显著降低，因此泪腺局部的细胞凋亡数量减少，正常泪腺细胞得到保护，使处于凋亡早期宣判阶段的细胞退出凋亡程序。对于雄性去势大鼠来说，这可能密蒙花总黄酮发挥了雄激素替代的作用有关，黄酮类物质与泪腺组织中雄激素受体结合后，泪腺中的Bax mRNA明显减少，而bcl2，cmyb及AR mRNA都明显增加，从而抑制了泪腺局部的细胞凋亡，与Toda等实验结果相符合。根据本研究结果，我们认为，密蒙花提取物滴眼剂一方面可以发挥拟雄激素效应，另一方面还可以抑制泪腺腺泡和腺管细胞的细胞凋亡，打破泪腺损伤的恶性循环，从而提高泪液基础分泌量，维持泪膜稳定性，改善眼表干燥状态，尤其适合围绝经期、衰老、自身免疫性疾病、服用抗雄激素药物等引起雄激素水平下降所导致的干眼症，具有良好的治疗效果。

【参考文献】

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7姚小磊，彭清华，吴权龙.密蒙花提取物治疗兔去势所致干眼症.眼视光学杂志2008;10(1)：2126

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9姚小磊，彭清华，吴权龙，等.密蒙花提取物对去势导致干眼症白兔泪腺细胞凋亡的影响.中国中医眼科杂志2007;17(3)：139144

10吴权龙，彭清华，姚小磊，等.密蒙花提取物滴眼剂对实验性干眼症大鼠泪腺组织形态学的影响.湖南中医药大学学报2009;29(5)：2225

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12 Gao J， Schwal TA， Addeo JV, et al. The role of apoptos is in the pathogenesis of caine keratoconjunctivitis sicca: the effect of topical cyclosporin A therapy. Cornea 1998;17(6):654663

13 Toda I, Wickham LA, Sullivan DA. Gender and androgen treatment influence the expression of protooncogenes and apoptotic factors in lacrimal and salivary tissues of MRL/lpr mice. Clin Immunol Immunopathol 1998;86(1): 5971

14 Azzarolo AM, Wood RL, Mircheff AK, et al. Androgen influence on lacrimal gland apoptosis， necrosis， and lymphocytic infiltration. Invest

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