信号转导和转录激活因子3和转化生长因子1在系统性红斑狼疮患者外周血中的表达及其临床相关性

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种自身免疫性疾病，以产生多种自身抗体、补体系统激活及免疫复合物沉积为特征，进而引发组织器官损伤，其病因及发病机制尚未明确。近年的研究提示免疫调节异常在SLE的发病中起主导作用，其中包括免疫细胞的调节异常，而免疫细胞的功能又是通过细胞内信号转导来实现的。信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,S'1'AT3)是转录信号传导子与激活子通路的重要成员，该通路参与多种生长因子与细胞因子等细胞内信号转导，调节细胞增殖、分化及凋亡。转化生长因子(transforming growth factor,TGF)在人体中存在TGF-队3三种亚型，在细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节等方面起着重要的作用，有报道SLE患者TGF-(3，表达水平增高y，亦有报道降低[2-3]，为了进一步探索STAT3、TGF-[3}在SLE中的作用和临床意义，我们研究了S'T}1T3,TGF-(3、在外周血单一核细胞(PB11C)中的表达，这可能有助于SLE发病机制的阐明及治疗。

1资料和方法

1.1资料

1.1.1研究对象SLE患者共40例，均来自2011年12月一2012年8月于天津医科大学总医院住院者，其中男6例，女34例，年龄1671岁，平均(40.60士13.64)岁。病程1396个月，平均病程(56.24士81.72)个月。对照组40例，为同期天津医科大学总医院健康体检者，男17例，女23例，年龄2467岁，平均(44.78士13.21)岁。两组在性别、年龄等一般资料力一面比较差异无统计学意义(P>0.05)。

诊断标准参照1997年美国风湿病学会推荐的SLE分类标准我们在排除其他疾病后，如果在标准中的11项中有4项或4项以上者符合诊断SLE}SLE病情活动性的评估以SLED Al(s:一*-temic lupus erythematosus disease actin it}"index)为判断标准。本实验经过院伦理委员会的同意并与患者签署了知情同意书。

1.1.2主要试剂及仪器RNAisoplus,RT-PCR试剂盒、引物(内参GAPDH,STAT3,TGF-(31，且引物终浓度均为10 p.,mol/L)(大连宝生物工程有限公司)G APDH:上游引物5'-GCACCGTCAAGGCTAG.4AC-3'，下游引物5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'，扩增产物片段大小为138 bp;STAT3:上游引物5'-CACATG CCAC`l l'TGGTGTTTCA-3'，下游引物5'-GGGCAATCTC CATTGGCTTC-3'，扩增产物片段为164 by;TGE-(3,上游引物5'-GCGACTCGCCAGAGTGGTTA-3'，下游引物5'-GTTGATGTCCACTTGCAGTGTGTTA-3'，扩增产物片段大小为100娜;焦炭酸二乙醋(DEPC)(美国prome}a公司);实验室超纯水系统ELGAPURELAB Ultra(英国ELGA Lab Water公司);小刑高速冷冻离心机5415D、台式高速大容量离心机58048、核酸蛋白测定仪(德国Eppendon公司);实时荧光定量PCR仪RG-3000(澳大利亚Corbett Research公司);全自动蒸汽消毒柜、s-325(日本TOM￥公司);超低温冰柜RMA-702美国Thermo Eorma公司)。

1.2力一法

1.2.1样本处理两组样本均采取2 mL外周静脉血，乙二胺四乙酸(EDT助抗凝，并于一80℃低温冻存。

1.2.2 PB}IC总RNA提取严格参照RNAisoplus试剂盒中说明书的步骤和实验条件进行。

1.2.3总RNA纯度测定取2},L总RNA，加人DEPC灭菌蒸馏水，空白对照为去DEPC灭菌蒸馏水，在核酸蛋自测定仪上分另」读取260 nm,280 nm和A,}/A}。的比值以及总RNA的浓度。

1.2.4反转录反应、SYBR Green I实时荧光定量PCR参照RT-PCR试剂盒中说明书，按照反转录试剂盒操作说明将RNA转录成cDNA，反应条件为:37 0C,15 min,85 0C,5、二PCR采用25.0},L反应体系:cDNA 2.0}.,L,SYBR Premix Ex 1ag

1.2.5匹，上下游引物各0.5},L，经过高温高压消毒的生物蒸水9.5,PCR反应条件:94 0C 20 s 1个循环，94℃20 s 40个循环，65 0C 30、40个循环，72℃35 s 40个循环，75℃5:40个循环二然后记录各个因子的CT值采用△CT进行分析，CT与mRNA表达量呈反比。取4},L PCR产物混合于5时J 6x电泳缓冲液中，琼脂糖凝胶电泳(120 V,40 min)，采用凝胶成像系统成像检测扩一增产物的纯度。

1.3统计学方法使用SPSS16.0统计软件进行分析。基因的相对一定量用△CT表i1:(CT值表ids每个PCR反应管内荧光信号到达没定的阂值时所经历的循环数，CT=目的基因Crh值一内参基因C1'值，mRN A表达量与△CT值呈反比关系)二计量资料符合正态分布的，以均数士标准差(x1s)表刁、，两组计量资料间比较采用独立样本t检验(两组资料数据方差齐)，不符合正态分布的采用秩和检验;soAT3,TGF-}i因子之间及与临床指标的关系采用相关性分析，正态分布的采用Pearson相关性分析，不符合正态分布的采用Spearman相关性分析，以P<0.05判定为差异有统计学意义

2结果

2.1总RNA纯度检测上述提取的PBMC中mRl}'A的A耐128。比值在1.82.2之间，符合实验的要求。

2.2 STAT3,TGF-(3,mRNA扩增产物的鉴定扩增曲线是PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线，两个因子的扩增曲线均显示曲线拐点清楚，标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势，各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近(图1-3)

2.3 STAT3,TG1'-(3,在SLE患者与正常人PBMC中的表达由表1看出，SLE患者组STAT3,TGF-(3,的△CT值均小于正常对照组目_有统计学意义(`P均<<0.01)，因为△CT值与mRNA的表达量是成反比的，故SLE患者组STAT3,TGF-(3，的mRNA表达量相对正常对照组是升高的，且具有统计学意义;活动期SLE患者组STAT3,TGF-(3，的mRNA的表达量相对于静止期患者组是升一高的(*P<0.01,*'P<0.05);静止期SLE患者组STAT3,TGF-(3,的mRNA的表达量相对于正常对照组是升高的(*P<0.01,`'P<0.05);不同性另!!SLE患者STAT3,TGF-(3,的mRNA表达量无显著性差异(P均>0.05)。

2.4 STAT3,T GF-(3，的表达以及与SLEDAI的相关性STAT3,TGF-(3」的△C'l值与SLEDAI呈负相关，其mRNA表达与SLEDAI呈正相关(r=-0.3 2,**P<0.05;r=-0.37，'*P<0.05);STAT3与TGF-(31 mRNA表达水平之间无相关性(r=0.04,P>0.05)2.5 STAT3,TGF-(3，的表达与临床的相关性与无发热患者相比有发热的SLE患者STAT3的mRNA表达量是升高的(*P<0.05)，而ST AT3,TGF-p:与其与他临床和实验室指标(皮疹、关节痛、口腔溃疡、脱发、神经系统损害、肾损害、血液损害)无相关性CP值均>>0.05)

3讨论

SLE是系统性自身免疫病,SLE的免疫异常与细胞因子密切相关，SLF患者体内许多细胞因子的水平异常，如肿瘤坏死因子、千扰素及IL-2,4,6,10等在SLE患者中水平明显高于正常人，与SLE疾病活动性及组织损伤有关0，上述细胞因子均可通过,J}}K/STA'T信号通路发挥其生物学作用，目前研究最多的通路上的关键信号分子包括STAT3,STAT3转导信号和活化转录的详细机制迄今尚未阐明，其大致的过程为CK受体(如工L-2受体、生长因子受体等)与配体结合后形成同源或异源受体复合物，在胞质域结合JAK、并引发自身和JAK、的酪氨酸磷酸化活化。Harada等问发现SLE患者T细胞中总STAT3和磷酸化STAT3的表达均比正常对照明显升高，而Fung等ni的研究也提示STAT3可能参与了SLE的发病，与本研究一致。

课题研究结果显示，SLE患者组PBMC中STAT3 mRNA水平明显高于正常对照组(P<0.05，提示STAT A表达与发热有关mRN和疾病的活动性相关。STAT3 mRNA mRNA与SLEDAI评分呈正相关，这提示STAT3 mRNA的表达依次增高，而且STAT3动期STAT3)，正常对照组、SI,E患者缓解期、活>0.05，而关于ST AT3表达与SI,E及临床和实验室指标相关性的研究甚少，有待于进一步的研究。TGF-p，由树突状细胞、巨噬细胞,T细胞和天然杀伤(NK)细胞分泌，具有负向调节免疫应答功能，可称为“免疫抑制因子”,TGF-日:的免疫抑制性在自身免疫病中具有保护作用。本研究结果显示活动期SI,E患者PBMC中TGF-(31 mRNA表达升高，与国内外研究相一致[[2-3,11-12]。这可能是由于TGF-日、在炎症早期有免疫刺激作用，并可作为趋化剂招募炎性细胞促进炎性细胞因子的生成，从而参与疾病发生和发展。另外，在IL-613{的协同作用下，TGF-(3，能诱导(:D4}`I'细胞向Thl7方向分化，产生IL-17，导致炎症发生，TGF-}3在Th17细胞促进炎症反应的发生中起重要作用ay。TGF-日和1L-6诱导ST AT 3活化，RORyt与STAT3共同作用于1L-17启动区，导致Th 17能够分泌IL-17}'S}。这样相互作用形成调控网络，TGF-(3在SLE中表达增加，在I1}-6的协同作用下诱导s'rA'r3活化，即S1'}T3的表达也增加，RoR}t与STAT3共同作用于IT,-17启动区，导致Th17分泌IL-17,IL-17的表达增加，这与本研究得出的STAT-3,TGF-(3，参加了SLE的发病而且mRNA的表达增加相符。

有研究表明TGF-(3在SLE患者中低于正常对照[[16-17，可能与样本含量有关，同时也提示SLE}}]发生不仅与TGF-[3的含量有关，也可能与TGF-(3的结构与功能有关。本课题研究结果显示，SLE患者PBMC中TGF-(3,mRI}A水平明显高于正常对照组(P<0.01)，正常对照组、sL.E患者缓解期组、活动期组TGF-(31 mRNA的表达依次增高，}I_TGF-日，mRNA与SLED AI评分呈正相关(P<0.05，这提示I'GF-[3,mRNA在SLE发病机制中具有一定的意义，且和病情活动性有关，可以作为判断SLE疾病活动性的指标，但其具体的机制有待进一步的研究。