梅毒螺旋体实验室检测技术概述

梅毒是国家规定的血液筛查的项目之一,在乙肝、丙肝、艾滋三个项目已经开始采用核酸筛查血液时,梅毒检测现阶段有哪些更好的方法可以用在血液筛查中提高血液筛查效果呢?最近⒛多年,随着科学技术的迅速发展,梅毒的检测方法与技术也取得了长足进步,不仅表现在检测试剂的灵敏度和特异性不断提高上,还表现在化学发光技术与核酸检测技术(NAT)的引人笔者现就梅毒螺旋体的实验室检测技术做一评述

1使用类脂质抗原的梅毒螺旋体血清学检测技术[1]

此类试验主要包括VDRL、USR、RPR、TRUSΓ等,其中VDRL和USR需要使用显微镜观察结果,RPR和RUST用肉眼观察结果。.

1.1VDRL(性病研究实验室试验)

⒛世纪50、60年代最为常用的梅毒血清学试验。反应素(梅毒螺旋体破坏机体组织过程中,机体产生的相应抗体)与抗原(从牛心中提取的心磷脂和从鸡蛋黄中提取的卵磷脂及胆固醇等有效成分)发生反应,试验时的摇动,使得反应素与抗原反应,形成的颗粒互相粘附,形成显微镜下可见的凝集沉淀,即为阳性VDRL试验有几个缺点,即抗原需要每日配置;血清标本需加热灭活;要在显微镜下观察结果。因此,后来又推出了改良的UsR和RPR。

1.2 UsR(不加热血清反应素试验)

本方法对VDRL抗原进行了改良,即将VDRL抗原稀释后,再将抗原悬液离心,然后在沉淀物中加人含有EDTA-Na2即氯化胆碱等的缓冲液。EDTA可使抗原半年内不变性,氯化胆碱可以灭活补体,这样就无需每天配置抗原,也无需血清加热灭活,但仍需显微镜下观察结果。

1.3 RPR(快速血浆反应素环状卡片试验)

本方法是在UsR抗原的基础上,加入特制的活性炭颗粒,这样,抗原抗体反应呈现出黑色的凝集颗粒,在白色纸片上,肉眼易于观察。

1.4 TRUsT(甲苯胺红不加热血清试验)

本方法是在前述抗原试剂中加人了甲苯胺红。甲苯胺红是一种颗粒均匀的化学染料,阳性结果呈现出红色的凝集颗粒,更加便于观察。目前,用于梅毒筛查的常用方法是TRUST和RPR。

上述4种试验都使用类脂质抗原,采用凝集反应方法测定,操作简单快速,但4种方法的特异性较差。多种疾病如类风湿关节炎、红斑狼疮等,会出现生物学假阳性。有报道在没有梅毒感染史的正常人群中上述实验会有0.1%的阳性率。TRUST方法曾经用于血液筛查,但从⒛00年起逐渐停用,取而代之的是灵敏度和特异性更高的酶免方法。

2使用密螺旋体抗原的梅毒螺旋体血清学检测技术

此类试验是梅毒特异性抗体检测试验,比较常用的有如下几种。

2.1TPHA(梅毒螺旋体血球凝集试验)本实验是以梅毒螺旋体作为抗原的间接血细胞凝集试验。所用抗原为将梅毒螺旋体血,hols株经超声裂解后得到的可溶性抗原成分,用其致敏火鸡或羊红细胞,然后用Reiter株(无毒株)制成的吸收剂稀释血清,吸收血清中的非特异性抗体。经过上述处理后TPHA试剂的特异性和敏感性均较高。本试验无需特殊设各,尚未实现自动化检测,试验中可发生自凝现象,需引起重视。由于HA试剂成本较高,且不能实现批1量自动化检测,因此本方法暂不适合用于血液筛查。

2.2 TPHA(梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验)

本实验原理与TPHA类似,其所用凝集颗粒为明胶颗粒而非红细胞。TPPA在⒛02年为美国疾病预防控制中心推荐用作梅毒确证试验,其灵敏度和特异性均较高,但试剂价格较贵。据文献报道,TPPA与耳LIsA检测结果之间符合性很好[2.3]。有报道称TPPA试验可以实现自动化检测,但未见TPPA试验自动化的明确报道。TPPA的自动化检测岜是笔者科研立项的题目。如果TPPA可以实现自动化检测,那本方法是很适宜用作血液筛查的。应用TPPA作为血液筛查方法其意义不仅在于它是一项确认试验,还在于进行献血者告之时给予肯定的结果,从而避免引起各种纠纷。

2.3 ELISA(酶联免疫吸附试验)本方法所用试剂经过十余年的发展,现采用基因工程的方法,得到高纯度的梅毒螺旋体外膜蛋白作为抗原,大大提高了试剂的特异性。用于检测TP的吒G和瑰M抗体。大量的试验表明其与TPPA,TPHA有较好的相关性[2’3]。本试验操作简单,可实现自动化检测,是梅毒血清学诊断试验的首选方法。现阶段血液筛查要求使用两个不同厂家生产的试剂进行筛查,本方法应用已经十分成熟。

2.4金标法本法是以基因工程生产重组纯化的TP外膜蛋白,采用胶体金标法和免疫层析技术进行TP抗体的检测,该方法快速,简便,但有假阳性的结果,需做进一步的确认试验。本方法主要用于街头血液TP的快速筛查。

2.5FTA~ABS(荧光螺旋体抗体吸附试验)

本试验为定性试验,是公认的“经典”血清学试验。它是将Nthols株抗原涂在玻片上,然后用Rotcr株制成吸收剂加人待测血清中,30mh后将混合血清加在涂有抗原的玻片上37℃孵育30而n,然后用PBS缓冲液冲洗晾干,加上荧光素标记的抗人,37℃孵育后冲洗晾干,最后用荧光显微镜观察结果。由于本试验需要荧光显微镜,以及不能进行自动化检测,因而不适合应用于血液筛查中。

2.6 WB(蛋白印迹技术)⒛世纪⒛年代蛋白印迹试验逐渐发展起来,它是一种膜上免疫测定技术。首先将梅毒螺旋体Nichols株菌体细胞用超声波破碎,再使用聚丙烯酰胺凝胶电泳将梅毒螺旋体各种抗原成分分开形成不同区带,经电转印可将这些条带转移到硝酸纤维素膜上作为抗原,最后用酶标技术检测病人血清中的相应特异抗原。如果出现特异性区带15,5KD和KD,这时即可确诊梅毒。这种方法通常作为筛查阳性标本的确认试验。RPR,胛A-A,和TPHA,TPPA等试验出现的假阳性,用本实验检测均为阴性,有研究表明本方法要优于上述这些方法,是一种很不错的确认试验。

3化学发光免疫分析法

本法是化学发光法和免疫分析法结合的产物,是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合,它采用化学发光反应试剂标记抗原或抗体,等其与待测物经过一系列反应后,测定发光强度以确定待测物的含量。该方法广泛用于各种抗原、抗体、酶、药物等物质的检测,是一项最新的免疫测定技术[4]。在检测梅毒抗体方面,三甲医院临床实验室逐渐采用化学发光免疫分析仪进行检测,在近几年的文献中多有报道,其结果与TPPA、EusA等符合性较好[5]。由于其自动化程度高,检测快速,灵敏度特异性与TP⒕持平或更高[5],因此在血液筛查检测中也是一个很好的选择,其唯一不足之处在于检测成本较高。

4 PCR(聚合酶链反应)

经过持续不懈的努力,对于梅毒螺旋体的基因结构已经清楚[7],是由1,138,OO6个碱基对组成的环状DNA链,有1041个开放读码框架,已经发现TP膜抗原有”种,内鞭毛蛋白36种,其中外膜蛋白婀KD蛋白和内鞭毛37KD蛋白具有高度免疫原性。以下就常用PCR的方法做一介绍。

4.1常规PCR

常规PCR首先要选取适宜的靶基因进行扩增。早在1990年,国外有学者使用tmp基因作为靶基因来设计相应引物,之后又曾尝试过bmp、Kda等基因,但效果均不理想。2000年时,经研究比较发现,polA基因具有较高的特异性和敏感性,随后将其用于引物设计。经过临床试验验证,其敏感性和特异性达到8%和95.7%,效果显著。常规PCR后期工作比较繁琐,因其需要做凝胶电泳。本试验需要重点控制的环节是防止扩增产物受到污染。

4.2多重PCR

本方法在常规PCR的基础上进行了改进。在使用靶基因作为引物设计上采用了多个特异性抗原基因设计多个引物同时扩增几条DNA片段。试验的反应原理、反应试剂、操作过程都与常规PCR一样。有学者应用多重PCR检测梅毒螺旋体感染者的标本后再与确认PCR比较,其一致率达∞,3%,而且该方法很适合在常规实验室使用[9]。

4.3实时荧光定量PCR[10]

本方法是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用对荧光信号积累的实时检测来监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。Holland及其同事最早提出了TaqMcan原理[11]。利用这一原理,设计出了%qMan荧光探针,使用实时荧光PCR仪实时检测荧光信号。在qMtnll荧光探针的基础上,进一步又发展了MGB探针[⒓]。我国学者徐瑾等构建了重组质粒PMD1:-T-TP,建立了利用MGB-Taqman探针的实时荧光定量PCR[13]。几年之后,Leshe等使用改进的实时荧光定量PCR与血清学方法比较,结果Real~Time PCR的敏感性和特异性均较高。与常规PCR相比,实时荧光定量PCR不仅不需要电泳确证,因其采用闭管荧光检测,还大大减少了假阳性。实时荧光定量PCR的过程自动化程度高,其高灵敏度和特异性也使其广泛应用于医学检测的各领域。

4.4巢式PCR

又称二次PCR,也即进行两次扩增。本方法首先用外引物进行第一轮PCR,利用第一次扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增。有报道称巢式PCR可检测1.6fg的TP DNA,因此适用于检测血清等标本中微量的梅毒螺旋体。多名学者设计试验对巢式PCR与常规PCR、血清学方法进行比较[1],实验结果显示巢式PCR与血清学方法无显著性差异,但与常规PCR有显著性差异。由于巢式PCR使用了两对引物进行了两次扩增,其敏感性和特异性均得到了增强,故可以作为血清学方法的补充用于梅毒螺旋体的诊断。

4.5逆转录PCR(RT-PCR)

本方法首先是提取目标细胞中总RNA,利用m弘NA做为模板,反转录生成cDNA,然后将DNA做为模板扩增,即可获得目的基因。虽然检测结果优于常规PCR,但其操作较常规PCR繁杂,注意事项较多,故不利于推广使用。梅毒是一种由苍白密螺旋体引起的传染病,最近几年发病率逐年上升,这种情况对输血安全构成了严重威胁。实验室检测梅毒的方法较多,梅毒研究中常使用WrB J"A和PCR三种方法;临床实验室常用的方法有EⅡSA、TRU叩、IPPA、化学发光法等;血液筛查是使用不同厂家的两种EⅡSA试剂进行。为了提高血液筛查水平,根据不同实验的特点,建议在血液检测中使用TPPA或化学发光法筛查梅毒,以便更好的保证输血安全。

参考文献

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[2]赵艳梅,周子昱,曹红荣.徐州市无偿献血者梅毒ELISA和TPPA检测结果分析[J].临床输血与检验,2012,(03):255-257.

[3]王伦善,吕蓉,盛琪琪.梅毒抗体酶联免疫吸附试验S/CO值与TPPA结果相关性研究[J].中国输血杂志,2011,(02):126-127.

[4]林金明,赵利霞,王栩.化学发光免疫分析[M].北京:化学工业出版社,2008.9-12.

[5]魏寿忠,林桂花,陈依平.化学发光法检测梅毒螺旋体抗体的效果评价[J].国际检验医学杂志,2012,(11):1351-1352.

[6]张旭东,马艳华,周少聪.微粒子化学发光法和梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验检测梅毒抗体的一致性比较[J].武警医学,2012,(09):756-757.

[7]Fraser CM,Norris SJ,Weinstock GM.Complete genome sequence of treponema pallidum,the syphilis spirochete[J].Science,1998,(5375):375-388.

[8]Rodes B,H Liu,S Johnson.Cloning and characterization of a gene polA coding for an unusual DNA polymeraseⅠfrom the obligate parasite Treponema pallidum[J].Journal of Medical Microbiology,2000,(49):657-667.

[9]Mclver CJ,Rismanton N,Smith C.Multiplex PCR testing detected higher than expected rates of cervical Mycoplasmas,Ureaplasmas,Trichomonas and viral agents in sexually active Australian women[J].Journal of Clinical Microbiology,2009,(05):1358-1363.

[10]李金明.实时荧光PCR技术[M].北京:人民军医出版社,2012.17-18.