复方鬼臼毒素凝胶的制备及质量控制

　　作者：李代程　　作者单位：635100 四川大竹，大竹县人民医院

　　【摘要】目的 制备复方鬼臼毒素凝胶，并建立其质量控制方法。方法 以鬼臼毒素、氟尿嘧啶为主药，卡波姆-940为基质制备凝胶剂;用高效液相色谱法测定鬼臼毒素的含量，用紫外-可见分光光度法测定氟尿嘧啶的含量。结果 成品为无色透明状半固体凝胶;鬼臼毒素在21.12～105.6μg/ml的浓度范围内有良好线性(r=0.9998，n=6),回收率为100.37%，RSD= 0.29% ;氟尿嘧啶回收率为100.4%，RSD=0.59%;样品在常温下避光贮存12个月内均无明显变化。结论 本制剂制备工艺简单、质量可控，可为临床治疗尖锐湿疣提供一种新型制剂。

　　【关键词】 复方鬼臼毒素凝胶;制备;质量控制;高效液相色谱法

　　尖锐湿疣(CA)是由于人类乳头瘤病毒(HPV)感染引起的性传播疾病之一，危害性大，其病情比较顽固并且容易复发[1]。复方鬼臼毒素凝胶系本院研制的一种治疗尖锐湿疣(CA)的外用凝胶剂，通过近年来的临床应用，该制剂在治疗肛门疣、阴道疣、外阴疣、龟头疣等方面取得了良好的效果。为保证制剂质量，准确地控制好除疣凝胶中鬼臼毒素和氟尿嘧啶的浓度，本文建立用高效液相色谱分析法测定该制剂中鬼臼毒素的含量和紫外-可见分光光度法测定制剂中氟尿嘧啶的含量，结果表明测定方法可靠易行，现报道如下。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器 紫外可见分光光度计UV-1700(日本岛津);高效液相色谱仪LC-10AVP(日本岛津),含两台LC-10Atvp型泵，SPD-M10Avp二极管阵列紫外可见检测器;紫外可见分光光度计UV-1700(日本岛津);电热恒温水浴锅(上海医疗器械厂);SNZ-143型光学显微镜(上海光学仪器厂); TG328B型电光分析天平(上海天平仪器厂)。

　　1.2 试药 鬼臼毒素、氟尿嘧啶标准品(中国药品生物制品鉴定所);甲醇为色谱级，其他化学试剂均为分析纯。

　　2 处方与制备

　　2.1 处方 鬼臼毒素2.5g, 氟尿嘧啶20g, 卡波姆-940 10g，甘油100g，月桂氮艹 卓酮30g，三乙醇胺10g,纯化水适量，制成1000g。

　　2.2 制备工艺 取甘油、卡波姆-940，月桂氮艹 卓酮置乳钵中研匀，并加适量纯化水，慢慢滴加三乙醇胺，边加边搅，使成凝胶，加入氟尿嘧啶混合均匀，再加入鬼臼毒素，搅拌均匀，最后加纯化水至1000g，搅匀即得。

　　3 质量控制

　　3.1 性状 本品为无色透明状半固体凝胶。

　　3.2 鉴别

　　3.2.1 鬼臼毒素 取经处理后的本品与鬼臼毒素对照品,分别加甲醇制成每1ml中含鬼臼毒素0.3mg的溶液,照高效液相色谱法[2]测定,本品的主峰保留时间应与对照品峰的保留时间一致。

　　3.2.2 氟尿嘧啶 取本品1g，置分液漏斗中，加氯仿10ml使溶解，用氢氧化钠溶液振摇萃取。取滤液5ml，加氢氧化钡试液2ml，生成紫色沉淀。

　　3.3 粒度检查 按粒度和粒度分布测定法[2]检查，结果均符合规定。

　　3.4 稳定性试验 将3批样品装入塑料软膏盒，避光，温度(25± 2)℃，相对湿度(60±10)%贮存12个月，每3个月取样一次，按凝胶剂[2]稳定性试验标准进行检验，结果均符合规定。

　　3.5 鬼臼毒素含量测定

　　3.5.1 色谱条件 色谱柱：Discovery C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：甲醇-水(48：52,V/V)，检测波长：292nm，流速：1.0ml/min,柱温25℃，进样量：10μl。鬼臼毒素的色谱见图1。

　　图1 空白(A)、对照品(B)及样品(C)色谱图

　　Fig 1 Chromatograms of black (A) and chemical reference substance(B) and sample(C)

　　3.5.2 线性范围 精密称取鬼臼毒素对照52.8mg,置100 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，再取1ml置25ml容量瓶中，分别去1ml、1.5ml、2ml、4ml、5ml进样(重复进样6次)供HPLC分析，记录色谱峰面积。以鬼臼毒素的峰面积(A)对其浓度(C)做回归，得回归方程为：A=4.284×105C+0.1629×105 (r=0.9998，n=6),结果表明，鬼臼毒素在21.12～105.6μg/ml范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系。

　　3.5.3 阴性对照试验 以除鬼臼毒素外的其他各成分制成阴性对照品，按“样品中鬼臼毒素含量测定”项下方法处理。结果显示，该阴性对照品不干扰样品中鬼臼毒素的含量测定。

　　3.5.4 鬼臼毒素对照品溶液的制备 精密称取鬼臼毒素对照品 5mg，置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为50μg/ml对照品溶液。

　　3.5.5 样品溶液的制备 精密称取复方鬼臼毒素凝胶约1.0g, 置分液漏斗中，加氯仿10ml使溶解，用盐酸溶液振摇萃取3次，取上液加热蒸干，加流动相使其溶解，置50ml容量瓶中，再加流动相至刻度，摇匀，即得样品溶液。

　　3.5.6 鬼臼毒素的含量测定方法 分别吸取对照品溶液和样品溶液各10ml，注入高效液相色谱仪，重复进样3次，测得鬼臼毒素的平均峰面积，以外标法测定其含量。试制样品3批，其测定结果是鬼臼毒素含量分别为标示量的100.4%、99.9%、100.2%。

　　3.6 氟尿嘧啶含量测定

　　3.6.1 对照液的制备 精密称取105℃干燥恒重的氟尿嘧啶对照品50mg，置100ml量瓶中，加盐酸溶液(9→1000)溶解加至刻度摇匀，精密量取2ml，置100ml量瓶中，加入上述盐酸溶液(下列所用盐酸溶液均与此相同)至刻度，摇匀即得。

　　3.6.2 样品液的制备 精密称取氟尿嘧啶乳膏2.5g(相当于氟尿嘧啶50mg)，置分液漏斗中，加氯仿25ml使溶解，用盐酸溶液振摇萃取3次，每次25ml，取萃取液置入100ml量瓶中，用盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml，置入100ml量瓶中，再用盐酸溶液稀释至刻度，摇匀即得。

　　3.6.3 阴性溶液的制备 用除氟尿嘧啶外的其他各成分配制凝胶，按照“样品液的制备方法”制备即得。

　　3.6.4 紫外吸收光谱 取对照品液、样品液和阴性溶液用紫外分光光度计在200～400nm波长范围扫描，结果在265nm波长有最大吸收，阴性溶液在200～400nm波长范围内无吸收，因此基质对样品的测定无干扰。

　　3.6.5 标准曲线的建立 分别精密量取100μg/ml的氟尿嘧啶溶液4、5、6、7、8、9、10ml分别加入100ml量瓶中，以盐酸溶液稀释至刻度，摇匀得到4～10μg/ml的系列氟尿嘧啶溶液，以盐酸溶液为空白，在256nm波长处测定吸收度，将数据进行回归处理，得到标准曲线方程A=0.0538C+0.1122(r=0.9998 ，n=7)，结果表明，在该范围内吸收度与浓度呈良好的线性关系，稳定性试验表明，4～10μg/ml的该溶液室温放置，24h内在265nm波长处测定吸收度无变化。

　　3.6.6 样品中氟尿嘧啶的含量测定 试制样品3批，分别用上述方法测量含量，其结果分别标示量的100.3%、98.7%、99.4%。

　　3.7 加样回收率试验 分别精密称取干燥恒重鬼臼毒素和氟尿嘧啶原料适量，按处方比例配制成已知含量的模拟样品5分(每分共制备100g)，分别取样品1.0g，按“样品中鬼臼毒素的含量测定”和“样品中氟尿嘧啶的含量测定”项下方法处理，鬼臼毒素和氟尿嘧啶平均回收率分别为100.37%和100.04%，RSD分别为0.29%和0.59%，结果见表1。 表1 鬼臼毒素回收率测定结果表2 氟尿嘧啶回收率测定结果

　　4 讨论

　　尖锐湿疣(CA)主要是人乳头瘤病毒(HPV)6、11[3，4]、16、18感染所致的性传播疾病，HPV侵入人体皮肤和黏膜局部上皮细胞，表现为病毒复制所致局部上皮增生、增厚，角化形成疣体[5]。尖锐湿疣(CA)发病率、复发率较高，本病与生殖器肿瘤的发生有一定的关系，故日益受到人们的重视[6]。鬼臼毒素为细胞抑制性药物，外用时，通过抑制受人乳头瘤(HPV)感染细胞的分裂增生，使之发生坏死、脱落，从而起到治疗尖锐湿疣的作用。　氟尿嘧啶为细胞周期特异性药物，主要作用于S细胞，对增殖细胞各期具有杀伤作用[7]，可使复发的疣体短期内消退[8]。鬼臼毒素与氟尿嘧啶联合应用，可增强对尖锐湿疣的治疗作用，同时降低了复发率。

　　卡波姆是丙烯酸与烯丙基蔗糖或季戊四醇交联而成的高分子聚合物，是一种优良的药剂新辅料[9]。卡波姆基质具有释药快，无油腻性，易涂展，对皮肤及黏膜无刺激性，能与水溶液混合并能够吸收组织渗出液，有利于分泌物排出的优点。用卡波姆-940为基质的复方鬼臼毒素凝胶具有性质稳定，质控方法可靠，配制简便的特点，且加入月桂氮艹 卓酮能增加药物在角质层的扩散性和溶解度，帮助药物穿过角质层，提高局部药物浓度，利于药物吸收。笔者将该制剂用于尖锐湿疣的治疗，取得了良好的效果，且未见明显副作用。

　　萃取分离后，采用高效液相色谱法测定鬼臼毒素的含量和分光光度法测定氟尿嘧啶的含量，鬼臼毒素和氟尿嘧啶相互不干扰,且基质也不干扰含量测定，测定结果准确。因此，本测定方法可用于复方鬼臼毒素凝胶的含量测定。

　　【参考文献】

　　1 杨军，廖元兴，张新元.1986～1995年间门诊性病统计分析. 中国皮肤性病学杂志，1999，13(3)：162-163.

　　2 国家药典委员会.中国药典，2005年版.北京：化学工业出版社，2005，二部：附录VD、IXE.

　　3 张明策，刘跃华，刘世德，等.尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒6、11型的检测及L1基因的序列分析.中国医学科学院学报，2000，22：463-466.

　　4 Brown DR,Bryan JT,Schroeder JM,et al.Neutralization of human papillomavirus type 11(HPV-11) by serm from women vaccinated with yeast-derived HPV-11 L1 virus-like particles:correlation with compe-titive radioimmunoassay titer.Infect Dis,2001,184:1183-1186.

　　5 赵红梅，苏艳芹.CO2激光联合氟尿嘧啶治疗宫颈尖锐湿疣.中国激光医学杂志，2003，12(3)：194.

　　6 赵辨.临床皮肤病学，第3版.南京：江苏科学技术出版，2001，535-538.

　　7 张嘉枫.5-氟尿嘧啶治疗尖锐湿疣50例疗效观察.浙江预防医学，2003，15(2)：1113.

　　8 郝春梅，赵敏.微波联合氟尿嘧啶外敷治疗复发性尖锐湿疣30例.中国皮肤性病学杂志，2003，17(6)：423.

　　9 冯端浩，郑毅.卡波姆在半固体制剂中的应用.中国医院药学杂志，1998，9(18):420.