血管内皮祖细胞与血管新生的研究

　　作者：姚丽萍,熊霞　　作者单位：四川，泸州医学院附属医院皮肤科

　　【关键词】 血管内皮祖细胞;血管新生

　　血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一类能分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞，不仅参与人胚胎血管生成，同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程。大量的研究显示，动员和移植的EPCs可提高缺血组织的血管新生能力，促进损伤血管的修复和再内皮化，这为治疗以坏死性血管炎为主要病理改变的一类疾病带来了新的希望。因此EPCs已成为目前的研究热点之一，本文就血管内皮祖细胞与血管新生的关系及其在治疗性血管新生中应用的研究进展作一综述。

　　1内皮祖细胞的来源

　　内皮祖细胞(EPCs)是近年来研究较多的一类细胞。1997年Asahara等[1]首次从成人外周血单个核细胞中分离得至CD34+细胞，因其在体外可向内皮表型细胞分化，表达内皮细胞标志物并且参与血管形成，故将此命名为EPCs。EPCs也叫成血管细胞，是一种多能干细胞，能循环、增殖并分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞，缺乏成熟内皮细胞的特征性表型，不能形成管腔样结构。EPCs起源于胚外中胚层卵黄囊血岛，由位于血岛外层的造血/成血管细胞(又称原血干细胞，是造血干细胞和内皮祖细胞的共同起源)分化发育而来。目前，许多研究证明，EPCs在成人外周血，人脐带静脉血和骨髓中均有分布，且人外周血、脐带血的EPCs均来自于骨髓。EPCS的来源还有多潜能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cells，MAPCs)、骨骼肌[2]。Lin等[3]发现骨髓来源的EPCs增殖能力明显高于成熟循环内皮细胞，两者体外扩增能力之比为50:1。在骨髓内EPCs与造血干细胞和骨髓基质细胞之间存在着密切联系，造血干细胞和骨髓基质细胞可影响EPCs的发育、增殖、动员和迁移。Murahara等[4]用免疫磁珠分离法从脐血中成功地分离出EPCs，这些细胞经培养可以摄取as-LDL，释放NO，表达VE-cadherin、CD31和vWF。在体外扩增后回输到裸鼠肢体缺血模型，发现EPCs参与了缺血局部新生毛细血管的形成，因此脐血可成为EPCs研究的细胞来源。Gehling等[5]从G-CSF动员的外周血中分离到CDl33+细胞，在VEGF和干细胞生长因子的诱导下形成了内皮细胞。

　　Zengin等[6]研究发现在成人几乎各个脏器的大中血管的平滑肌和外膜之间存在一个“血管发生区域”，该区域中也存在着CD34+ 、VEGFR-2+的EPC，并且有少部分细胞为CD45+。该区域可能是出生后血管发生的源泉，且与肿瘤的血管生成有关。

　　2EPCs的表面标记

　　由于EPCs与造血细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)有着共同的起源，所以它们具有许多共同的表面标记，如CD34、CD133、VEGFR-2、Eph等;EPCs进一步分化为成熟内皮细胞，两者都表达内皮细胞特异性的表面标志，包括VEGFR-2、Tie-1、Tie-2和VE-cadherin[7]。 这些相同的表面标记使EPCs的分选变得非常困难，其中有3个最重要的表面标志：CD34、CD133、VEGFR-2。一般将CD34 +/CD133 +/KDR(VEGFR-2 + 或Flk-l + )的细胞定义为EPCs。有研究表明，同时表达CD133、VEGFR-2和CD34的细胞具有迁移并分化为成熟内皮细胞的能力，能够促进出生后的血管形成。

　　CD34是一种白细胞分化抗原，它选择性地表达在造血前体细胞、血管内皮细胞、间质前体细胞和各种问质肿瘤细胞中，是骨髓、外周血和脐血中HSCs的主要标志，可同时识别出包括HSCs、EPCs和成熟内皮细胞的混合细胞群。从外周血中分离出的CD34细胞在体外能够向内皮细胞分化，在体内能够促进新生血管形成，因此，这些细胞可能大多数为EPCs。但是，近来研究发现，CD34-细胞群体中也含有EPCs [8]，这使得用CD34来富集EPCs的方法受到挑战。

　　CD133(又称AC133)是存在于人细胞表面的糖蛋白，相对分子质量为120 000的糖基化多肽，含有5个跨膜结构域，包括膜外的N端及胞浆内C残端，选择性地在人类胎肝、骨髓和血液来源的CD34+造血干/祖细胞上表达，在向成熟的内皮细胞分化过程中其数量迅速减少，在成熟血管内皮细胞上未见CD133的表达。因此，它可作为用于区别成熟内皮细胞和EPCs的分子标记，是目前分离EPCs最常用的表面标志

　　血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2)即鼠的胎肝激酶1(fetal liver kinase，Flk-1)和人的含有激酸插入区域的受体是在胚胎干细胞向内皮细胞分化过程中最早表达的内皮标志[9] ，也可以作为EPCs高富集的分子标记。循环中的EPCs表达干/前体标记物，如CD34或VEGFR-2，但无CDl33，同时开始表达内皮系的特殊标记物，如VE粘钙蛋白或E-选择蛋白。VEGFR-2和VE粘钙蛋白被认为是EPCs区别于HSCs的标志[10]。

　　通过对EPCs表面标记物的识别，我们可以对EPCs进行分离、培养。目前最经典的EPCs体外培养方法是从骨髓或外周血中分离出单个核细胞，或直接分离出表达CD34、CDl33和VEGFR-2的单个核细胞，接种在纤维连接蛋白包被的平皿表面，加入VEGFR-2等促内皮生长因子和胎牛血清培养基，培养4~7天后就能形成内皮细胞集落(endothelial cell colony-forming unit，CFU-EC)，其形态特点是以许多小圆形细胞分布为中心，周围放射状分布着大量的纺锤形状的内皮细胞，对这些细胞分析可发现它们能表达CD31、KDR、CDl44、VE-cadherin、vWF等血管内皮细胞所特有的细胞表面标记。

　　3EPCs的影响因素

　　正常情况下，骨髓中EPCs处于休眠状态，在很多刺激因素作用下动员到体循环，导致外周循环血中EPCs的数量增加，并迁移到特定的位点分化增生，形成内皮细胞并促进血管发生。目前已证实对EPCs有动员作用的因素包括生长因子：VEGF、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胎盘生长因子(placenta growth factor，P1-GF)、促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)等;致炎细胞因子：粒-巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、基质细胞衍生因子(stroma cell derivation factor-1，SDF-1);药物和激素：他汀类药物、血管紧张素转化酶抑制剂、雌激素等;机体某些生理或病理状态：组织缺血 、不稳定型心绞痛 、急性心肌梗死时外周血中EPCs迅速增加。Satoh等[11]在低氧5周的大鼠中发现他汀类药物通过抑制SDF-la/CXCR4和ICAM-1/CDl8途径减少骨髓来源的EPCs的动员及归巢。不少文献己证实，EPCs在VEGF或缺血刺激下确可分化为成熟内皮细胞，它在体内具有明显的内皮修复和促血管新生作用[12]。Urao等[13]证实EPO可诱导EPCsAkt/eNOS磷酸化和NO合成，增加EPCs的动员而抑制损伤动脉的内膜增生。此外，体育锻炼[14]和磁场[15]也可以使外周循环中EPCs的数量增加。相反，在糖尿病、吸烟、高脂血症、老龄化、冠心病[16]等状态下，外周血中EPCs的数量减少，EPCs的分化、迁移、黏附及形成血管能力也显著下降。

　　4EPCs与血管新生

　　血管新生(neovasculorization)包括两个基本过程：即血管发生(vasculogenesis)和血管生成(angiogcnesis)。血管发生是指内皮前体细胞，即成血管细胞分化成内皮细胞从头形成原始血管网的过程。血管生成是指从已存在的血管长出新毛细血管的过程。胚胎时期机体通过血管发生和血管生成两个过程形成新血管，成年后新血管生成起先被认为是由血管生成的机制所构成，由预先存在的内皮祖细胞增生和迁移所控制，但通过对外周血EPCs的观察和研究，人们对于生后新血管生成的理解有了新的认识，即不仅存在血管生成，也包括血管发生。实际上，在组织因供血障碍导致缺血缺氧的情况下，上述不同类型的血管新生都有可能发生，但可能以某种形式为主。这一理论，已在临床中得到证实，将自体干细胞植入缺血的肢体，可促进局部血管生成。

　　血栓的机化和再通过程是个动态而复杂的过程，由其微环境决定。近年来发现EPCs在这个过程中发挥着很大的作用，Striring等[17]用一个不可渗透膜把栓子和血管壁隔开，栓子中的裂隙同样有内皮细胞贴附，机化同样会发生。从而说明血栓的再通中，内皮细胞不仅仅是从自血管壁上迁移而来，可能还来自循环血液中的EPCs。

　　EPCs通过下列可能的机制参与新生血管生成和内皮细胞更新。(1)整合(incorporation)机制：研究表明[18-19]将体外标记的EPCs移植到缺血或血管内膜剥离动物模型后，可在缺血组织新生血管壁内或再生的血管内皮层检测到标记物及CD34双阳性细胞。加上上述细胞在血管生成的培养条件下，具有向内皮细胞定向分化的能力。因此，人们推测归巢于缺血组织的EPCs，在VEGF等细胞因子的作用下，能够直接整合至生成中的新生血管壁内，并增殖分化为成熟血管内皮细胞，参与新生血管的形成。同样，归巢于与损伤血管内膜的EPCs，在局部微环境的作用下，分化为血管内皮细胞，参与损伤血管内膜的再生。(2)融合(fusion)机制：很久以前，人们就发现单核细胞和巨噬细胞具有自发融合、形成多核巨噬细胞的能力。最近几个研究表明，成体干细胞与胚胎干细胞共同培养具有融合倾向，且融合细胞表现为全能分化特性[20]。 一些学者认为在缺血组织新生血管壁内观察到的供体源性且表达CD34的细胞极有可能为EPCs与局部血管内皮细胞融合的结果。(3)旁分泌(paracrine)机制：无论为整合机制还是融合机制，在缺血组织中EPCs的整合率或融合率均是非常低的。但EPEs移植后，却能显著地增加新生血管的数目、促进损伤血管的再内皮化。其原因可能为EPCs除通过上述机制起作用外，还以旁分泌的形式影响着局部血管生成因子的释放。研究表明，体外培养的EPCs具有分泌VEGF、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)的能力;HSC可以表达VEGF、Ang-1的Mrna;骨髓单个核细胞能够释放VEGF和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)。因此，移植体内的EPCs也可通过释放细胞因子的途径，促进成熟血管内皮细胞的增殖、迁移，增强成体血管生成的经典途径血管形成的能力。

　　5问题和展望

　　目前，干细胞研究是生物医学领域研究的热点之一。EPCs与血管新生的关系展现了其潜在的治疗价值，在缺血疾病、生物工程材料等方面有广泛的研究应用前景。但是关于EPCs的研究还有不少问题有待解决，如EPCs的细胞表面标志尚未完全明确，分离、鉴定和培养方法的标准化，EPCs动员、分化、归巢的机理，EPCs促血管新生和内皮修复作用的分子机制等，这些都需要长期而深入的研究。

　　【参考文献】

　　[1]Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science，1997，275：964-967.

　　[2]Arsic N，Mamaeva D，Lamb NJ，et al.Muscle-derived stem cells isolated as non-adherent population give rise to cardiac.Skeletal muscle and neural lineages[J].Exp Cell Res，2008，314(6)：1266-1280.

　　[3] Lin Y ，Weisdorf DJ，Solovey A，et al.Origins of circulatings endothelial cells and endothelial outgrowth from blood[J].J Clin Invest，2000，105(1)：71-77.

　　[4]Murahara T,Ikeda H，Duan J,et al.Transplanted cord blood-derived endothelial precurosor cells augment postnatal neovascularization.J Clin Invest，2000，105(11)：1527-1536.

　　[5]Gehling UM，Ergun S，Schumacher U，et al.In vitro differentiation of endothelial cells from AC133 positive progenitor cells[J].Blood，2000，95：3106-3122.

　　[6]Zengin E，Chalajour F，Gehling UM，et al.Vascular wallresident progenitor cells：a source for postnatal vasculogenesis[J].Development.2006，133(8)：1543-1551.

　　[7] Nguyen VA，Furhapter C，Obexer P，et al.Endothelial cells from cord blood CD133(+)CD34(+)progenitors share phenotypic，functional and gene expression profile similarities with lymphatics[J].J Cell Mol Med,2009,13(3):522-534.

　　[8]Harraz M.Jiao C，Hanion HD.et al.CD34-blood-derived human endothelial cells progenitors[J].Stem Cells，2001，19：304-312.

　　[9]Hirashima M ，Kataoka H，Nishikawa S，et al.Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an vitro model of vasculogenesis [J] .Blood，1999，93：1253-1263.

　　[10]Cines D，Pollak E，Buck C，et al.Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders[J].Blood，1998，91：3527-3561.

　　[11]Satoh K，Fukumoto Y，Nakano M，et al.Statin ameliorates hypoxia-induced pulmonary hypertension associated with down-regulated stromal cell-derived factor-1[J].Cardiovasc Res，2009，81：226-234.

　　[12] Wemer N，Kosiol S, Schiegl R，et al.Circulating endothelial progenitor cells and cardiovascular outcomes[J].N Engl J Med，2005，353(10)：999-1007.

　　[13]Urao N.Okigaki M.Yamada H.Erythropoietin-mobilized endothelial progenitors enhance reendothelialization via Akt-endothelial nitric oxide synthase activation and prevent neointimal hyperplasia.2006，98(11)：1405-1413.

　　[14]Sarto P，Balducci E，Balconi G，et al.Effects of exercise training on endothelial progenitor cells in patients with chronic heart failure[J].J Cardiac Fail，2007，13：701-708.

　　[15]Barzelaia S，Dayana A，Laniadoa S.Increased expression of bone marrow derived endothelial progenitor cells following exposure to magnetic field[J].J Mel Cell Cardiol，2007，42：S93-94.

　　[16]刘燕荣，陈君柱，王兴祥，等.冠心病患者外周血内皮祖细胞的数量和功能变化[J].浙江大学学报医学版，2006，32：163-166.

　　[17] Stiring GA，Tsapogas MJ，Girolami PL.Organization of thrombi[J].Br J Surg，1996，53：232-235.

　　[18] Reyes M，Dudek A， Jahagirdar B， et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow[J].J Clin Invest，2002，109：337-346.

　　[19]Kocher AA,Schuster MD，Szaboles MJ，et al.Neovascularization of ischemic myocardium by human bone derived angioblasts prevents cardio myocyte apoptosis，reduce sromodeling and improves cardiac function[J].Nat Med，2001.87：430-436.

　　[20]杨志明，边云飞，萧传实.血管内皮祖细胞在血管新生疗法的应用[J].中华老年心脑血管病杂志，2002，14(6)：421-422.