系统性红斑狼疮患者外周血调节性T细胞与IL10及TGFβ1的检测

　　作者：赖仁建　　作者单位：韶关市曲江区人民医院，广东 韶关 512100

　　【摘要】目的研究系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞(regulation T cells，Tr细胞)及相关细胞因子的变化，分析它们在SLE发病机制中的作用。方法：收集SLE患者及健康对照组外周抗凝静脉血，分离纯化T淋巴细胞。PE标记的抗CD4单抗，FITC标记的抗CD25单抗，作双色流式细胞术，分析SLE患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞百分率，ELISA法检测调节性T细胞相关细胞因子的表达。结果：SLE患者外周血Tr细胞的数量明显低于正常对照组[(2.83±1.05)% vs(5.07±0.59)%，P<0.05];患者血清中IL10、TGFβ1的含量均低于正常对照组，差异有显著性[IL10：(29.48±13.69)pg/ml vs(43.10±14.95)pg/ml，P<0.05;TGFβ1：(170.04±91.58)pg/ml vs(254.75±130.41)pg/ml，P<0.05]。患者外周血Tr细胞的比例与血清中IL10 、TGFβ1的含量呈正相关(r1=0.53，r2=0.64，P<0.05)。结论：SLE患者外周血存在细胞免疫功能失调，CD4+CD25+调节性T细胞数量与功能状态发生改变，T淋巴细胞耐受机制的破坏可能与SLE的免疫学发病机制有关。

　　【关键词】 系统性红斑狼疮;调节性T细胞;IL10;TGFβ1

　　Detection of CD4+CD25+ Regulation T Cells and Related Cytokine in Peripheral Blood in SLE Patients　LAI Renjian　Qujiang People’s Hospital, Shaoguan，GuangDong 512100，China

　　Abstract：Objective To investigate the amount of CD4+CD25+ regulation T cells and the level of related cytokine in peripheral blood in SLE patients, and analyze the relationships between CD4+CD25+ regulation T cells and the immunopathogenesis of SLE. Methods CD4+CD25+ regulation T cells were detected by flow cytometry in peripheral blood.Besides, related cytokines in peripheral blood were assayed by ELISA. Relativity between CD4+CD25+ regulation T cells and related cytokine was analyzed. Results CD4+CD25+ regulation T cells were decreased obviously in peripheral blood in SLE patients compared with control group [(2.83±1.05)% vs(5.07±0.59)%，P<0.05]. The level of related cytokine was also decreased in SLE groups compared with control groups[IL10：(29.48±13.69) pg/ml vs(43.10±14.95)pg/ml,P<0.05;TGFβ1：(170.04±91.58) pg/ml vs(254.75±130.41)pg/ml，P<0.05].There were positive relationships between CD4+CD25+ regulation T cells and related cytokine IL10, TGFβin SLE patients (r1=0.53，r2=0.64，P<0.05). Conclusion Celluar immunological function disorder is observed in SLE patients, and the abnormal expression of CD4+CD25+T cell and related cytokines in peripheral blood may involve in SLE immunopathogenesis.

　　Key words:Systemic Lupus Erythematosus; Regulatory T cell; IL10 ;TGFβ1

　　系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus ，SLE)是一种由于自身免疫反应引起的慢性炎性疾病,以多个器官和组织受累及血清中有多种自身抗体为特征，但因发病机制尚不清楚，还难以找到真正特异而有效的治疗方法。大量资料证明它是在遗传、环境、感染和性激素等因素的影响下出现的细胞免疫功能失调所致。而CD4+CD25+调节性T细胞在自身免疫病中的作用逐渐被成为免疫学领域研究的热点，但到目前为止关于该细胞在SLE患者体内的研究资料较少，因此通过研究CD4+CD25+调节性T细胞在SLE患者外周血中的数量和功能的变化,将为SLE的发病机制以及从免疫调节的角度治疗SLE提供新的思路，同时也为我们进一步研究开发CD4+CD25+调节性T细胞疫苗和其他自身免疫性疾病的发病机制奠定重要的理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　28例SLE患者取自本院，男11例，女17例，年龄28岁~49岁，平均年龄34岁，均符合SLE诊断标准，并于用药前取外周抗凝血;正常对照28例取自本院体检中心,为健康人群，排除SLE及其他自身免疫性疾病，其中男10例，女18例，年龄25岁~51岁，平均年龄36岁。

　　1.2 试剂和仪器

　　EPICSXL型流式细胞仪(Beckman公司)、淋巴细胞分离液(AXISSHIELD公司)、9600型基因扩增仪(PE公司)、AntiCD4PE、AntiCD25FITC(EB公司)、MsIgG1FITC、MsIgG1PE(Miltenyibiotec公司)、小牛血清, IL10、TGFβ1的ELISA检测试剂盒。

　　1.3 研究方法

　　1.3.1 外周血T细胞的分离

　　无菌采集SLE患者及正常人外周静脉血4 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离得单个核细胞。无菌玻璃培养皿37℃培养30 min，去除粘附于玻璃培养皿的单核细胞，以获取悬浮的淋巴细胞。加入0.85%NH4Cl溶液溶解红细胞，经T细胞分离富聚柱采用负筛选法获得获纯化的T淋巴细胞。用20%的小牛血清RPMI1640培养液调整细胞浓度约2×106/ml。

　　1.3.2 外周血CD4+CD25+T细胞的检测

　　取2支试管，各加入100 μl T细胞悬液，2管分别加入小鼠抗人单克隆IgG1PE和小鼠抗人单克隆IgG1FITC(阴性对照管)、抗CD4PE和抗CD25FITC各种标记抗体均20 μl。混匀，4℃避光30 min，PBS洗涤2次，各管加入0.5 ml缓冲液，上流式细胞仪检测。

　　1.3.3 外周血细胞因子IL10、TGFβ1的检测

　　收集SLE患者和健康对照组外周肝素抗凝血4 ml，室温静置30 min后取上清，离心后冻存于-70℃。ELISA法分别测IL10、TGFβ1的含量。

　　1.4 统计分析

　　所有结果以±s表示，两两比较采用t检验，经SAS8.22软件分析，取P<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 SLE患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞的数量

　　SLE组和对照组外周血中T细胞亚群比较(见表1)，SLE患者外周血Tr细胞明显低于对照组，差异有显著性(P<0.05)。Tr细胞所占CD4+T细胞的比例也低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。表1 SLE组与对照组外周血T细胞亚群比较(略)注：与对照组相比，*P<0.05

　　2.2 SLE患者外周血细胞因子的检测 SLE患者外周血清中IL10的含量明显低于对照组，差异有显著性(P<0.05)。SLE患者外周血清中TGFβ1的含量也明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。表2 SLE组与对照组外周血清中细胞因子的比较(略)注：与对照组相比，*P<0.05

　　2.3 CD4+CD25+调节T细胞与细胞因子的相关分析

　　SLE患者外周血中Tr细胞所占CD4+T细胞的比例与血清中IL10、TGFβ1的表达均呈正相关(r值分别为0.53、0.64，P<0.05)。而对照组Tr细胞数量与IL10、TGFβ1无相关性。

　　3 讨论

　　SLE是由多种因素影响导致的免疫功能失调的自身免疫病，目前病因尚未完全清楚，给临床治疗带来一定的难度。CD4+CD25+调节性T细胞是近年来研究发现的一类特定亚群的CD4+T细胞，存在于正常人外周血和脾脏中，是具有独特免疫调节作用的一种专职抑制细胞, 该细胞在经TCR介导的信号刺激活化后不仅能抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖,还能抑制其免疫功能,且这种免疫抑制性不具有MHC限制性，能够抑制同种同型或同种异型T细胞的增殖。这种功能使CD4+CD25+调节性T细胞成为维持机体免疫耐受的重要调控者，它对机体中自身反应性T细胞和部分效应性T细胞的选择性抑制是免疫自稳形成和维持的重要机制之一，其正常水平和功能有助于免疫系统对自身抗原的刺激建立良好的耐受状态，避免自身免疫病的发生。

　　目前国内外研究提示，CD4+CD25+调节性T细胞的数量减少或功能异常有可能导致多种自身免疫病的发生。如在风湿性关节滑液内存在大量的CD4+CD25+调节性T细胞，Cao等[1]认为这一现象可能与慢性炎症的发生、发展和转归有关; Sullivan等[2]发现患有先天性胸腺功能低下的患儿外周血CD4+CD25+T细胞的绝对计数显著低于正常婴儿，推测这些患儿易发生自身免疫病与其在发育早期严重缺失CD4+CD25+T细胞亚群有关;Sugiyama 等[3]研究表明银屑病患者，CD4+CD25+调节性T细胞功能异常，免疫失调，使体内致病性T细胞大量增殖。Sarween等[4]研究发现CD4+CD25+调节性T细胞不仅抑制致病性CD4+T细胞增殖,也能抑制其组织浸润。它可允许病理T细胞的激活，但阻止其分化和迁移到产生抗原的组织，从而避免IDDM的发生。Balandina 等[5]通过实验证实重症肌无力的发病机制与CD4+CD25+调节性T细胞表型与功能缺陷有关。我们研究发现SLE患者外周血CD4+T、CD25+T、CD4+CD25+调节性T细胞数量明显低于正常对照组，这可能与SLE患者细胞免疫功能低下有关，而SLE患者体液免疫功能增强有关，B细胞活化产生大量的自身抗体[6]，这可能是Tr细胞数量减少，不能正常抑制B细胞的功能。因此我们研究开发提升调节性T细胞的疫苗将有助于SLE的临床治疗。

　　我们还研究发现SLE患者外周血中IL10、TGFβ1的含量也降低，同时Tr细胞占CD4+T细胞的比例与IL10、TGFβ1的含量呈正相关。Tr细胞活化后主要通过细胞接触依赖机制或抑制性细胞因子依赖机制主动发挥免疫抑制作用，它可分泌大量的IL10、TGFβ1等抑制性细胞因子，用相应抗体中和此类细胞因子则其体内免疫抑制作用降低，说明Tr细胞的功能可以通过这些抑制性细胞因子来实现[7]。这些细胞因子具有抑制抗原呈递细胞及拮抗效应性T细胞的功能，在Tr细胞介导的免疫耐受及Tr细胞的产生和增殖中发挥着重要作用[8，9]。有研究认为在细胞因子机制中,以通过分泌IL10 的方式对效应性T细胞抑制作用更明显[10]。因此我们推测可能由于SLE患者外周血中Tr细胞数量的减少，能够发挥有效免疫抑制作用的细胞数减少，导致自身反应性T细胞激活增多，凋亡减少。同时Tr细胞减少，产生抑制性细胞因子的含量降低，抑制能力下降，导致激活的自身反应性T淋巴细胞增多。

　　综上所述，SLE患者外周血中Tr细胞数量减少，分泌的细胞因子含量降低，可能导致细胞免疫抑制功能减弱，自身免疫耐受平衡被打破，出现激活的自身反应性T细胞增多;此外，T淋巴细胞激活增多，还可辅助B细胞产生更多相关抗体。 这说明SLE患者体内Tr细胞的免疫抑制功能可能下降，细胞免疫失调，体液免疫的耐受机制被打破，导致患者体内产生多种自身抗体，表现出多种临床症状。

　　因此通过诱导CD4+CD25+调节性T细胞的数量及相关细胞因子的表达，可为治疗SLE提供一个新途径;对SLE患者体内调节性细胞的深入研究，可能会进一步揭示SLE的发病机制,为临床诊断、治疗与预防提供重要的理论依据。

　　【参考文献】

　　[1]Cao D, Malmstrom V, BaecherAllan C, et al. Isolation and functional characterization of regulatory CD25 bright CD4+ T cells from the target organ of patients with rheumatoid arthritis[J]. Eur J Immunol，2003，33(1):215223.

　　[2]Sullivan KE, McDonald McGinn D, Zackai E. CD4+CD25+T cell production healthy humans and in patients with thymic hypoplasia[J].Clin Diaglab Immunol,2002,9(3):1129.

　　[3]Sugiyama H, Gyulai R, Toichi E, et al.Dysfunctional blood and target tissue CD4+CD25 high regulatory T cells in psoriasis:mechanism underlying unrestrained pathogenic effector T cell proliferation[J].Immunol，2005，174(1):164173.

　　[4]Sarween N, Chodos A, Raykundalia C, et al.CD4+CD25+ cells controlling apathogenic CD4 response inhibit cytokine differentiation, CXCR3 expression, and tissue invasion[J]. J Immunol，2004,173(5):29422951.

　　[5]Balandina A, Lecart S, Dartevelle P, et al.Functional defect of regulatory CD4+CD25+T cells in the thymus of patients with autoimmune myasthenia gravis[J].Blood，2005,105(2):735741.

　　[6]Richaud PY, Alcocer VJ, Llorente L. High levels of TH2 cytokine gene expression in systemic lupus erythematosus[J]. Rev Invest Clin,1995，47(4):267269.

　　[7]Maloy KJ, Salaun L, Cahill R, et al. CD4+CD25+T(R) cells suppress innate immune pathology through cytokinedependent mechanisms[J]. J Exp Med,2003,197:111119.

　　[8]Masaki H, Cherry IK, Masanori N, et al. IL10 is required for regulatory T cells to mediate tolerance to alloantigen in vivo[J]. J Immunol，2001，166(9):378396.

　　[9]Yamagiwa S,Gray J, Hashimoto S, et al . A role for TGFβ in the generation and expansion of CD4+CD25+ regulatory T cells from human peripheral blood[J]. J Immunol，2001,166(12):728729.

　　[10]FengNing Zhan,Wu Hongfei,Wu Jun, et al. Immunology Mechanism of CD4+ CD25+ T Regulatory Cells Acting on Effect or T Cells[J]. Journal of Nanjing Medical University，2004,18(4):178182.