银屑病患者骨髓CFUHPP集落形成及集落细胞 p16基因启动子甲基化的研究

　　作者：张瑞丽,牛旭平,李新华,张开明,尹国华　　作者单位：太原市中心医院皮肤科，太原 030009

　　【摘要】本研究检测银屑病患者骨髓高增殖潜能集落形成单位(CFUHPP)的集落形成能力及集落细胞p16基因启动子甲基化状态，并探讨两者之间的关系。收集了24例银屑病患者及正常对照者骨髓，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，并于含SCF/GMCSF/IL3/IL6细胞因子组合的甲基纤维素半固体培养液中，培养14天计数CFUHPP集落，然后收集集落。提取纯化集落细胞的DNA，经亚硫酸盐修饰后，采用甲基化特异PCR(MSP)检测CFUHPP集落细胞的p16基因启动子甲基化状态。结果发现：在甲基纤维素半固体培养基中，银屑病患者骨髓CFUHPP集落数显著低于正常对照(t=5.91， p<0.01)，且集落形态较小;正常对照骨髓CFUHPP 集落细胞的p16基因启动子甲基化阳性率较高(66.7%)，而银屑病患者骨髓CFUHPP 集落细胞p16基因启动子甲基化阳性率(37.5%)低于正常人。结论：银屑病患者骨髓CFUHPP细胞集落形成能力降低;银屑病患者骨髓CFUHPP集落细胞的p16基因甲基化降低可能与其相对较低的CFUHPP集落形成能力密切相关。

　　【关键词】 高增殖潜能集落形成单位

　　Abstract This study was purposed to investigate the colony formation of highproliferative potential colonyforming units(CFUHPP) from bone marrowderived hematopoietic cells of psoriatic patients and p16 gene promotor methylation in CFUHPP cells， and to explore the relationship between the colony formation and the methylation status of p16 gene promoter. Bone marrowderived mononuclear cells from psoriatic patients and normal controls were separated by density gradient centrifugation, and were cultured in methycellulose semisolid culture medium with SCF，GMCSF，IL3 and IL6 for 14 days to measure the colonies of CFUHPP. The CFUHPP colony cells were collected and methylation status of p16 gene promoter of CFUHPP cell DNA modified with sodium bisulfite was detected by the methylationspecific polymerase chain reaction (MSP). The results showed that in methycellulose semisolid culture system, the number and the size of CFUHPP colonies of bone marrow of psoriatic patients were all significantly less than that of normal controls, the positive frequency of p16 gene promoter methylation in CFUHPP cells was lower than that in CFUHPP colony cells of normal controls. It is concluded that the colony formation capability of CFUHPP from bone marrow hematopoietic progenitor cells in psoriatic patients is lower than that in normal controls, and the lower positive frequency of P16 gene promoter methylation in CFUHPP cells perhaps closely correlated with lower CFUHPP colonyforming capability.

　　Key words psoriasis; highproliferative potential colony forming unite; P16 gene; gene methylation

　　J Exp Hematol 2007; 15(4):780-784

　　银屑病是一种以T细胞为主、多种免疫细胞共同参与发病的慢性炎症性皮肤病。根据近年研究结果我们首次提出银屑病发病与骨髓造血细胞密切相关的全新观点，并初步发现银屑病患者骨髓造血细胞及微环境有异常[1-4]。p16基因主要参与细胞周期调控，其启动子甲基化可使基因失活，p16基因转录沉默，导致细胞的过度增殖。为揭示银屑病患者骨髓造血前体细胞体外增殖活性及其与p16基因启动子甲基化状态的关系，本实验对银屑病患者骨髓高增殖潜能集落形成单位(CFUHPP)的增殖情况进行了观测，并对集落细胞的p16基因启动子甲基化状态进行了研究。

　　材料和方法

　　标本来源

　　中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(4)银屑病患者骨髓CFUHPP集落形成及集落细胞p16基因启动子甲基化的研究24例患者均为2005年3—10月太原市中心医院皮肤科门诊和住院病人，经临床和病理检查确诊为进行期寻常型银屑病。24例患者中男14例，女10例，平均年龄35.2岁，病程10-50天。取材前1个月内局部或全身均未使用过皮质类固醇激素和免疫抑制剂，髂后上棘采集骨髓5 ml(所有取材均征得患者同意)，肝素抗凝。正常对照24份骨髓，取自血液科骨髓检查正常后筛选出的正常对照者，其中男11例，女13例，年龄19-40岁，平均32.2岁。

　　主要试剂

　　淋巴细胞分离液、二巯基乙醇(2ME)购自上海恒信化学试剂有限公司，IMDM购自Gibco公司，胎牛血清(FCS)、氢化可的松(HK)、重组人干细胞因子(rhSCF)均购自TBD公司，甲基纤维素、L谷氨酰胺(LGLn)、青霉素、链霉素均购自Sigma公司，牛血清白蛋白(BSA)购自BBI公司，重组人粒、巨噬细胞系集落刺激因子(rhGMCSF)购自北京邦定泰克生物有限公司，重组人白介素3(rhIL3)、重组人白介素6(rhIL6)及重组人红细胞生成素(rhEPO)均购自R&D SYSTEMS。Genomic DNA Purification Kit试剂盒及Wizard DNA CLeanup system试剂盒均购自Promega公司，Sss I 甲基转移酶购自NEB公司，亚硫酸氢钠、对苯二酚、醋酸氨、引物及DNAMarker均购自上海生物工程技术有限公司，PCR反应试剂盒购自华美公司。

　　骨髓CFUHPP的培养

　　密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(BMMNC)，用含10% FCS的IMDM洗3次，调整细胞浓度至2×106/mL，按2×105/ml浓度将BMMNC接种于CFUHPP培养体系(30% FCS，105mol/L 2ME，1% BSA， 2 U/ml rhEPO，3% LGLn，10-6mol/L HK, 20 U/ml rhIL3，20 U/ml rhIL6，50 U/ml rhSCF，50 U/ml rhGMCSF及0.9%甲基纤维素)。采用国际通用的干细胞培养方法[5]，将上述培养体系成分逐一加入24孔培养板内,用力混匀,最后加入银屑病患者及正常对照者BMMNC。培养体系每孔总体积0.5 ml，设复孔,轻轻摇匀,使细胞均匀分布,不聚集成团,于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中孵育。倒置显微镜下定期观察细胞生长状况，培养14天后，致密集落直径≥0.5 mm或松散集落直径≥1 mm者为CFUHPP，统计培养孔内CFUHPP集落数。

　　CFUHPP集落细胞的收集

　　用吸管吸取银屑病患者及正常对照者CFUHPP集落细胞，用IMDM洗细胞3次;向细胞沉淀物中加入细胞冷冻液，轻轻吹打混匀，计算细胞总数，使细胞浓度为1×107/ml，按每管1.5 ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖;在冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。将冻存管于-86℃保存。

　　细胞DNA的提取

　　采用Genomic DNA Purification Kit(Promega公司)试剂盒提取集落细胞DNA ，按说明书操作，所提的DNA于-20℃冻存。

　　引物设计与合成

　　根据参考文献[6,7]进行引物设计，由上海生物工程技术有限公司合成。p16基因甲基化特异的引物上游： 5′TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC3′，下游：5′GACCCCGAACCGCGACCGTAA3′，扩增产物片段为150 bp; p16基因非甲基化特异的引物上游：5′TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT3′，下游：5′CAACCCCAAACCACAACCATAA3′，扩增产物片段为151 bp。

　　基因组DNA的亚硫酸盐修饰[8]

　　取2 μg模板DNA，蒸馏水定容至50 μl，95℃加热20分钟，加入新配制3 mol/L的NaOH液11 μl，使终浓度为0.3 mol/L，42℃孵育20分钟;加入亚硫酸氢钠处理溶液(将5.41 g亚硫酸氢钠加入8 ml三蒸水中，用10 mol/L NaOH 调整pH为5.0;将0.22 g氢醌溶解在10 ml水中，取500 μl加入亚硫酸氢钠溶液中，定容至10 ml，0.45 μm滤膜过滤)600 μl,充分混匀后，低速离心1分钟，上盖矿物油，55℃水浴孵育14-16小时;经修饰的DNA用Wizard DNA CLeanup system试剂盒纯化除去游离的亚硫酸氢钠，在每离心管中加入3 mol/L的NaOH液5.5 μl，37℃ 20分钟;加入66 μl 5 mol/L醋酸氨中和后，加入冰乙醇500 μl沉淀DNA，摇匀30分钟， 于-20℃过夜;用70%乙醇洗涤，离心，弃上清，干燥后，用20 μl蒸馏水悬浮，-20℃冻存。

　　甲基化特异性PCR(MSP)

　　用Sss I 甲基化酶处理的正常人外周血DNA经亚硫酸氢钠修饰后作为甲基化阳性对照，亚硫酸氢钠修饰后的正常人外周血DNA为非甲基化阳性对照。MSP的反应体系：反应总体积25 μl，其中10×PCR缓冲液2.5 μl，25 mmol/L氯化镁2.0 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，上下游引物各1 μl，TaqDNA聚合酶5 U/μl 0.5 μl，模板5 μl，补足双蒸水至总体积25 μl，在PTC100型扩增仪上进行循环，反应条件为： 95℃预变性10分钟，95℃变性1分钟，51℃退火55秒(非甲基化退火温度为52℃)，72℃延伸1分钟，共45个循环，最后72℃终延伸10分钟，4℃保存。

　　产物检测及结果判定

　　取10 μl PCR反应产物，2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下观察结果。p16基因甲基化特异PCR产物为150 bp，p16基因非甲基化特异PCR产物为151 bp。如修饰后样品仅扩增出150 bp条带，显示该样品有甲基化;如修饰后样品仅扩增出151 bp条带，显示该样品无甲基化;如修饰后样品扩增出150 bp和151 bp两个条带，显示该样品为半甲基化或部分甲基化，属于甲基化[9]。

　　统计学处理

　　用SPSS 11.5统计软件包进行资料分析，正态分布的计量资料以± SD表示，CFUHPP集落数采用两样本t检验;计数资料采用χ2检验和Fisher's 精确概率法。检验水准α=0.05， p<0.05认为统计学差异有显著性。

　　结 果

　　细胞生长状况的观察

　　培养即刻观察显示，细胞分布均匀;培养3天时细胞明显增多，孤立散在分布;培养7天细胞数明显减少，但有形成细胞集簇的倾向;培养14天时肉眼可见集落形成，集落中心致密，边缘松散均匀(图1、2)。

　　银屑病患者骨髓CFUHPP与正常人骨髓CFUHPP集落形成的比较

　　统计学分析显示，银屑病患者骨髓CFUHPP与正常人骨髓CFUHPP集落形成数相比有统计学差异 (附表)，银屑病患者骨髓CFUHPP集落数显著低于正常对照组，且集落形态较小。

　　PCR产物电泳结果和分析

　　MSP检测结果显示，24例银屑病患者骨髓CFUHPP集落细胞中，9例p16基因启动子呈现异常甲基化，甲基化率为37.5%;24例正常对照中，16例p16基因启动子呈现异常甲基化，甲基化率为66.7%;两组比较， χ2=4.48， p<0.05，差异有统计学意义，银屑病患者骨髓CFUHPP集落细胞p16基因启动子甲基化率显著低于正常对照组(图3)。

　　讨 论

　　银屑病发病机理研究已成为国际性热点和难点问题。在上个世纪80年代以前银屑病研究集中于表皮，认为表皮异常是银屑病发病的主要原因。近年研究表明，免疫学异常特别是T细胞异常在银屑病发病中发挥主要作用，故目前认为银屑病是一种主要由T细胞介导的免疫性疾病。国外报道显示，在给同时患银屑病的恶性血液系统疾病患者进行骨髓移植过程中偶然发现，移植后患者的银屑病可以永久性消退[10]，而无银屑病的血液病患者接受患银屑病供者的骨髓后，可能因供者的异常免疫转移给受者，从而使受者出现银屑病，当再次接受骨髓移植后银屑病可复发[11]。结合国内外的研究结果，我们提出骨髓是银屑病发病中枢的全新观点[1]。国外对银屑病骨髓异常曾进行过少数研究，Meuret等[12]研究发现，银屑病患者单核细胞生成能力显著增强;Altmeyer等[13]应用Tc99m标记的人血清蛋白微粒进行功能性骨髓显像分析，显示银屑病患者骨髓吞噬细胞有异常增殖。新近我们研究发现银屑病患者外周血单个核细胞培养上清可抑制正常骨髓造血干细胞集落形成[2];银屑病患者骨髓CD34+细胞体外定向分化T细胞部分具有银屑病患者外周血T细胞某些发病特点[3]。CFUHPP体外培养实验可反映造血祖细胞的存在、数量、增殖分化能力及对造血因子的反应能力。为了进一步研究银屑病患者骨髓造血祖细胞体外增殖活性是否有异常，我们采用甲基纤维素半固体培养基培养观察了24例银屑病患者骨髓CFUHPP集落形成情况。研究结果显示，银屑病患者骨髓CFUHPP集落数显著低于正常人骨髓CFUHPP，且集落形态较小，这表明银屑病患者骨髓CFUHPP集落形成能力较正常人降低，提示银屑病患者骨髓造血祖细胞体外增殖活性异常。

　　DNA甲基化是在甲基转移酶介导下将胞嘧啶(C)加上一个甲基变为5甲基胞嘧啶(5MC) 的一种反应，是除缺失与突变之外的第3种调控基因表达的机制，在基因转录调控中起重要作用[6]。哺乳动物DNA甲基化发生在CpG二核苷酸胞嘧啶上，富含CpG的顺序称为CpG岛，启动子区CpG岛甲基化可以在转录水平抑制基因表达。人的p16基因定位于9p21，全长8.5 kb，由3个外显子和2个内含子组成。p16基因编码的P16蛋白为CDK4的抑制蛋白，与细胞周期素D竞争CDK4，抑制CDK4的活性，对细胞增殖周期起负性调节。p16基因5'端启动子区域的CpG岛高度甲基化是最重要的调控失活机制之一[14,15]，可使基因沉默不能转录，从而失去对细胞周期的正常调控，导致细胞的无限增殖。p16基因启动子区的甲基化可能参与胃癌、大肠癌、白血病等多种恶性肿瘤的发生发展。但是，骨髓造血细胞p16基因启动子甲基化状态研究尚未见报道。通过对银屑病患者骨髓CFUHPP集落细胞p16基因启动子甲基化变化检测结果显示，银屑病患者骨髓CFUHPP集落细胞p16基因启动子区甲基化阳性率显著低于正常对照者(χ2=4.48， p<0.05)，表明银屑病患者骨髓CFUHPP集落细胞p16基因呈低甲基化状态，同时提示银屑病患者骨髓CFUHPP集落形成能力降低可能与其集落细胞p16基因低甲基化密切相关。

　　【参考文献】

　　1张开明，李新华. 骨髓，银屑病发病"中枢"? 中国皮肤性病学杂志，2004;18：501-503

　　2徐海涛，尹国华，张开明等. 银屑病患者外周血单个核细胞的培养上清液对骨髓造血干细胞和祖细胞集落形成的影响. 中华皮肤科杂志，2006; 39：143-145

　　3尹国华，李新华，张开明等. 银屑病患者骨髓CD34+细胞体外定向分化的T细胞活性研究. 中华皮肤科杂志，2006; 39：124-127

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　　13Altmeyer P，Munz DL，Chilf G，et al. Morphological and functional findings of fixed phagocytes in psoriatics. Arch Dermatol Res,1983; 275:95-99

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　　15GonzalezZulueta M, Bender CM, Yang AS, et al. Methylation of the 5ˊCpG island of the p16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing. Cancer Res, 1995; 55:4531-4535