超氧化物歧化酶修饰改造的研究进展

　　作者：史春艳,左夏林,丁宇,李谨,丁克祥　　作者单位：长春市中心医院，吉林 长春 130051 南方医科大学研究生学院 华中科技大学同济医学院附属同济医院 汉川市人民医院皮肤科 南方医科大学科研部

　　【关键词】 超氧化物歧化酶;修饰;基因重组;模拟物

　　超氧化物歧化酶(SOD)广泛存在于自然界一切生物体内，通过催化超氧阴离子自由基(•O-2)发生歧化反应，减轻或消除•O-2对机体的氧化或过氧化损害。研究表明，机体的衰老、病变及辐射伤害都与自由基(包括•O-2)的形成和损伤有关，故SOD有抗衰老〔1〕、抗辐射、抗炎症、抗自身免疫性疾病、抑制肿瘤和癌症〔2，3〕的功能。研究还表明，SOD与胃病〔2〕、帕金森综合症、老年痴呆症、心血管疾病等有着密切关系。目前，在医药、食品、保健品、化妆品、美容等行业也已开始使用SOD。SOD具有许多独特的生物学特性和生理学功能，但天然的SOD稳定性较差，分子量较大，且多来源于异源性，具免疫原性，而限制了其在相关领域的应用〔4〕。目前国内外已有很多的研究，如采用化学修饰、基因重组、SOD模拟化合物来解决天然SOD所带来的问题，这已成为当今SOD研究中的一个热点。本文对目前国内外此方面的研究进行综述。

　　1 化学修饰

　　大部分酶分子中可供修饰的功能基团主要是氨基、巯基、胍基、咪唑基、酚基、羟基和吲哚基等，SOD的修饰目前主要限于Cu，ZnSOD的氨基和胍基。国内外已进行了大量的SOD的化学修饰的研究工作，并已取得了理想的结果。所用的修饰剂包括聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、玻璃酸、环糊精、低抗凝活性肝素、多糖类物质等。有些已投入生产，但这些修饰的SOD还没有作为药物应用。在美国，已经进行了PEGSOD用于治疗脑外伤的Ⅲ期临床试验。因此，从开发新药的角度，研究修饰SOD大有可为，如口服超氧化物歧化酶Glisodin是经过修饰后能不被胃液破坏的SOD。

　　1.1 聚乙二醇SOD 有学者为了解决SOD半衰期短，易受蛋白酶水解而失活，分子量偏大，不易透过细胞膜等问题，尝试对SOD进行分子修饰，国内外用水溶性高分子物质聚乙二醇(PEG)作为修饰材料，与SOD分子表面赖氨酸残基上的εNH2缩合，形成无毒，无免疫原性，半衰期长的修饰物，其活化简单但回收率低。动物实验结果显示，PEG修饰的SOD较其他修饰的SOD对小鼠肌肉缺血再灌注损伤具有更好的保护作用。Noda〔5〕将Cu，ZnSOD与琥珀酸角蛋白片段连接，小鼠静脉注射后，半衰期由4.7 min延长到20.5 min，并且能够迅速被肝脏吸收，失活速度也低于未修饰对照。孙桂玲〔6〕等用相对分子质量为2×103～2×104的PEG并修饰SOD，发现分子质量为6×103的PEG修饰效果最佳，其耐热、耐酸、耐碱和抗酶解能力均有显著的提高(在70℃下3 h后活性存留率比天然SOD提高37.2%，在pH4.4和pH11的缓冲液中3 h后活性存留率分别比天然SOD提高33.8%和25.9%，在人工胃液和人工肠液中3 h活性残余率分别比天然SOD提高32.1%和17.4%)。孔庆胜等〔7〕研究证明，PEG修饰的SOD的血浆半衰期为30 h，远远大于天然SOD 8 min左右的半衰期,且PEGSOD免疫原性消失，不能引起免疫反应。

　　1.2 右旋糖酐修饰SOD 右旋糖酐对SOD进行化学修饰已获得成功，它是利用右旋糖酐分子结构中的羟基经过BrCN或NaIO4活化，形成有活性的衍生物，再与SOD共价结合。SOD经化学修饰后不仅保留了天然酶活性，而且在耐热、耐酸碱及抗蛋白酶水解能力等方面明显优于天然酶，特别是酶经修饰后大大延长了在体内停留时间，如天然牛血SOD的t1/2为6 min，而右旋糖酐SOD、低分子聚蔗糖(Ficoll)SOD、高分子聚蔗糖SOD、聚乙二醇SOD的t1/2分别为7、14、24、35 h。

　　1.3 月桂酰氯修饰SOD 国内均坤生物工程有限公司以低分子月桂酰氯为修饰剂，对SOD进行共价修饰，获得了半衰期长、比活高、稳定性强、无毒性、低分子量的月桂酰氯修饰SOD(LauricacidSOD，LASOD)，并进行了透皮吸收、稳定性等试验和化妆品应用效果的观察，结果表明LASOD的热稳定性显著高于未修饰SOD，SOD的修饰是通过将SOD与月桂酰氯分子中存在的多个活性反应基团形成多点交联，使酶的天然构象产生“刚性”，不易伸展打开，同时减小酶分子内部基团的热震动，从而增强了酶的稳定性。SOD经月桂酰氯修饰后扩大了pH稳定范围，这是由于修饰酶被“固定”于更活泼状态，当基质pH下降、上升时酶仍能保持这种活性状态，使催化剂功能不受影响。另外，将同一浓度的LASOD和天然SOD分别加入10%胃蛋白酶溶液，导致蛋白多肽键断裂，交联于SOD上的月桂酰氯能产生空间障碍，阻挡蛋白水解酶接近SOD，能“遮盖”SOD分子敏感键遭破坏，说明其具有抗蛋白酶水解能力。

　　1.4 多糖物质修饰SOD 此类修饰剂主要为低抗凝活性肝素(LAAH)、羧甲基纤维(CMC)，羧甲基几丁质、硫酸软骨素(CHS)和甘露聚糖。LAAH和SOD一样,都是体内氧自由基的天然清除剂，用LAAH对SOD进行修饰，在SOD抗辐射和抗炎的应用中能发挥协同作用，且可以加强SOD的抗心血管疾病的能力〔8〕。Valdivia 等〔9〕将羧甲基纤维素氧化后与活化的β环糊精(βCD)连接，所得βCDCMC聚合物使SOD糖苷化，获得的SODCDCMC血浆内半衰期达到天然酶的90倍，抗炎活性达到天然酶的2.2倍。CHS广泛存在于人和动物软骨组织中,具有防治冠心病，防治动脉粥样硬化、抗炎、抗肿瘤、加速伤口愈合的作用。Maksimenko等〔10〕将SOD 和过氧化氢酶(CAT)用硫酸软骨素一起共价修饰,生成SODCHSCAT修饰结合物，其具有良好的抗血栓协同作用，其中SODCHS能消除血栓，而CATCHS则保持血流畅通，延缓血管闭塞。同时CAT的存在能消除对SOD具有毒性的H2O2产生的协同效用使SODCHSCAT的效功效加大。

　　2 重组SOD

　　为解决天然SOD免疫源性的问题，美、日、英、德等国相继开发了人源SOD基因工程产品，已进入到Ⅱ期、Ⅲ期临床研究，但其疗效不一。根据Jadot等同源SOD不被细胞膜受体辨认而无活性的观点，应对重组人源SOD的研究开发持谨慎态度，注意其应用领域。中国医学科学院基础医学研究所和中国药品生物制品检定所及海军总医院分子生物学研究室已经成功在大肠杆菌中表达了人Cu，ZnSOD，表达率高达50%。有学者分别以人胎肝组织及人肝细胞株(L02)总RNA为模板，以RTPCR法获得hCuZnSOD和hMnSOD cDNA，构建表达质粒pETSOD，并导入E.coli细胞中使之表达，结果分别获得了38%和50%的高表达率，且表达的SOD有酶活性。目前，国外应用基因重组人源SOD(rhSOD)对类风湿关节炎及免疫系统疾病的治疗做了大量研究，并取得显著效果，已进入Ⅱ期、Ⅲ期临床阶段。国际生物学界采用的基因重组法制取人源SOD(rhSOD)是SOD制备的最前沿技术，具有高安全、高活性、高质量等优势。重组SOD虽然在一定程度上解决了免疫反应的等问题，但仍有其他问题，目前重组SOD存在的问题：(1)半衰期很短;(2)重组SOD要恢复有活性的天然构象比较困难，因此其活性比天然SOD低;(3)临床使用剂量偏大。所以在重组人源SOD的开发中，需要更深入的研究，寻找更先进的方法来解决重组人源SOD所带来的问题。

　　3 SOD 的模拟化合物

　　与天然SOD相比，SOD的模拟物有着更显著的优点〔11，12〕。SOD的模拟化合物的获取和制备比天然SOD简单，且天然SOD产量不高。模拟SOD可以用化学方法来人工合成，其物质和能量消耗低，且产量不会受到限制。另外，天然SOD作为一种生物大分子,穿透力弱、细胞渗透性差、在血中半衰期短、免疫原性、不能口服、价格昂贵。目前,研究者合成了一系列含铜、锰、铁等金属离子的小分子配合物来模拟SOD，期待将来能用小分子模拟化合物代替SOD应用于临床〔13，14〕。其中研究最多的含铜络合物是3,5二异丙基水杨酸铜,这是一种低分子量的亲脂性络合物,具有天然CuZn SOD样活性,可以起到抗炎及减轻由链脲菌素诱导产生的糖尿病。刘京萍等〔15〕合成的铁(Ⅱ)酪氨酸模拟SOD 金属酶, 分子量比天然酶小得多,与天然SOD 活性差距较小，且毒性小，从而大大推进了人工合成具有分子质量较小、稳定性高、毒性较底、活性较高等优点的SOD模拟物的研究工作及应用。

　　4 结 语

　　SOD在临床上主要用于延缓人体衰老，防止色素沉着，消除局部炎症，特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及辐射防护，是很有临床价值的治疗酶。但半衰期短、稳定性差、免疫原性等因素限制了SOD的临床应用。为解决这些问题，目前国内外用化学修饰、基因重组和SOD修饰物等改造方法来延长半衰期、增强酶的稳定性、降低酶的免疫原性，且取得了很大的进展。这对于SOD未来的应用前景有着重要的意义。

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