新疆Kaposi肉瘤与皮肤鳞状细胞癌感染HHV8阳性率的比较研究

　　李振飞1 普雄明 作者单位：(1新疆医科大学, 2新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科, 新疆乌鲁木齐830000)

　　【摘要】 目的探讨Kaposi肉瘤与皮肤鳞状细胞癌(SCC)感染人类疱疹病毒8型(HHV8)的差异。方法用巢式PCR分别扩增30例鳞状细胞癌和30例Kaposi肉瘤组织皮损中的HHV8 DNA。结果30例皮肤鳞状细胞癌皮损组织有5份为阳性(16.7%)，30例Kaposi肉瘤组织有28份为阳性(93.3%)。结论鳞状细胞癌感染HHV8的阳性率较低，但并不除外HHV8为新疆皮肤鳞状细胞癌的病因之一。

　　【关键词】 人疱疹病毒8型; 鳞状细胞癌; Kaposi肉瘤; ORF26

　　Abstract: ObjectiveTo investigate the different rate of Herpes vinrus hominis8 (HHV8) infection between kaposi sarcoma (KS) and skin squamouscelled carcinoma (SCC). MethodsThirty specimens of SCC of skin and Thirty specimens of KS were collected to detect HHV8 expression by nesting PCR. ResultsThe positivity rate of HHV8 infection in SCC of skin was 16.7%(5/30), while that in KS was 93.3%(28/30). ConclusionThere was lower HHV8 infection rate in skin SCC, but that may be the cause of skin SCC in Xinjiang.

　　Key words: HHV8; SCC; KS; ORF26人类疱疹病毒8型(Human herpesvirus8，HHV8)又名Kaposi 肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcomaassociated herpesvirus，KSHV)，属Rhadino病毒或者γ2疱疹病毒，与γ1疱疹病毒、EB病毒(EBV)同属人类γ疱疹病毒，是由Chang等[1]在1994年采用代表性差异分析法从1例AIDSKS患者的病变组织中发现的一种新病毒。目前研究发现，HHV8是所有KS类型、原发性渗出型淋巴瘤(Primary effusion lymphoma，PEL)以及多中心性Castleman病(multicentric Castleman disease，MCD)的重要病因。随着对HHV8与卡波氏肉瘤的关系的深入研究及其致病机制的相对明确，HHV8与一些非卡波氏肉瘤性疾病的相关性研究成为人们关注的焦点。为此，本研究采用巢式PCR方法，以HHV8中的ORF26分别检测了30例皮肤鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)皮损组织和30例Kaposi肉瘤组织中HHV8 DNA，初步探讨HHV8在新疆Kaposi肉瘤组织与鳞状细胞癌组织中对比性研究。

　　1材料与方法

　　1.1研究对象收集2000~2008年新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科收集的KS患者石蜡包埋皮损组织30份。皮肤鳞癌：2006~2009年新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科和病理科收集的石蜡包埋皮损组织30份。

　　1.2主要试剂与仪器试剂盒SK2492购于上海生物工程公司，含Taq 聚合酶、dNTP混合物，电泳仪(美国BIORAD)，iCycler PCR仪(美国BIORAD)，Biosens SC720凝胶成像系统(上海山富科学仪器有限公司)。

　　1.3方法

　　1.3.1病毒DNA的提取向含有石蜡组织的EP管中加入277 μl消化缓冲液(含有25 mmol/l EDTA，10 mmol/l Tris.cl，100 mmol/l Nacl)，10% SDS(十二烷基硫酸钠)，蛋白酶K(20 mg/ml)6 μl，55℃水浴过夜，灭活蛋白酶K，酚氯仿异戊醇法进行DNA的抽提，抽提的DNA置-20℃保存。

　　1.3.2引物的选择与合成外引物:ATCTATCCAAGTGCACACTCG(826846)和CTGGGAACCAAGGCTGATAGG(12911270);内引物:GATGGATCCCTCTGACAACC T(890910)和GGATCCGTGTTGTCTACG(12221204). (所选引物均由上海生工生物工程服务有限公司合成)。

　　1.3.3巢式PCR扩增对HHV8 ORF26基因片段使用巢式PCR方法扩增，取PCR缓冲液 2.5 μl、MgCl2 2.4 μl、20 pmol/μl的上下游引物各1 μl、5 U/μl的Taq聚合酶0.5 μl、2.5 mmol/L的dNTP2.5 μl及适当的灭菌水和DAN模板(巢式PCR 第1、2轮反应的DNA模板分别是4 μl和2 μl)配成25 μl的反应体系，循环条件是95℃预变性4 min，35个循环：95℃变性1 min，第1、2轮反应分别以53℃和48℃温度退火45 s，72℃延伸1 min，最后一个循环延伸5 min。PCR产物4 μl在含溴乙锭的1.5%琼脂糖胶中恒压100 V电泳50 min，每次反应均设阴性(灭菌水)和阳性对照(以已知阳性的Kaposi肉瘤病理组织标本扩增带作为阳性对照)，最终扩增产物片段为333 bp确定为目的片段。

　　1.4统计学处理应用SPSS软件对数据进行统计分析，采用确切概率法，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　本研究对HHV8 ORF26基因进行巢式PCR扩增及电泳(图1)，发现28例KS患者HHV8感染阳性，阳性率为93.3%;5例SCC患者HHV8感染阳性(4例为维吾尔族，1例为汉族)阳性率为16.7%，皮肤鳞状细胞癌皮损中HHV8 DNA检出率明显低于KS皮肤中的检出率，差异具有统计学意义(χ2 =35.62，P<0.05)。

　　图1HHV8 ORF26基因位点PCR产物电泳结果注：电泳带图示：“M”示Marker，“1～5”为阳性，“6～7”为阳性对照(333bp)，“8”为空白对照

　　3讨论

　　HHV8基因组为长170 kb,含HHV8 保守基因序列和编码调节因子、细胞因子特有基因序列,至少含89个开放阅读框架(open readingframe，ORF)，已有研究报道的 HHV8 亚型主要基于以下四个基因位点：基于 ORF26 可分为 4 种亚型 (A、B、C、D) ;基于ORF75分为5种亚型(A、B、C、N、E) ;基于ORFK1可分为7种亚型 (A、B、C、D、E、F、Z) ;基于ORFK15 可分为P和M等位基因型。研究表明，序列变异性在人疱疹病毒中非常普遍，最早揭示HHV8亚型是在ORF26基因位点，HHV8 ORF26序列是相对保守序列，属于晚期裂解期基因，305个氨基酸。ORF26编码小衣壳蛋白，具有免疫原性，可以作为判定KS和体腔淋巴瘤的特殊的血清学标记及HHV8检测的诊断依据。本实验结果显示，KS患者HHV8 ORF26感染阳性率为93.3%，SCC患者HHV8 ORF26感染阳性率为16.7%。皮肤鳞状细胞癌皮损中HHV8 DNA检出率明显低于KS皮损中的检出率。1995年Rady 等[2]检测了4 例非AIDS 器官移植后免疫抑制患者的33 份皮损(包括鳞状细胞癌(SCC)，HHV8 阳性率为82%。1996年Boshoff 等[3]检测了大量免疫正常和免疫抑制患者的SCC，结果HHV8均为阴性，与我们所检测的结果不一致。分析新疆皮肤鳞癌感染HHV8的原因可能是：(1)HHV8可能是SCC发病机制之一;(2)特殊的地域差异和日光中紫外线的照射对皮肤感受性不同引起的;(3)可能与HHV8在新疆地区普遍存在有关。2000年杜文慧等[4]通过免疫荧光法检测HHV8在新疆不同种族普通人群感染情况，柯族HHV8 IgG抗体阳性率最高为48%，维吾尔族次之为30.4%，哈萨克族为12.5%，汉族为16.9%。与KS机制相比较，HHV8引起SCC的可能机制是：(1)HHV8转化的内皮细胞(ECHHV8)可表达高水平的血管表皮生长因子(VEGF), 同时，SCC中表皮生长因子受体(EGFR) 结合力增加。因为，除造血系统外，EGFR几乎存在于所有组织中，它的基因拷贝数增加或过度表达，均能促进正常细胞的转化和恶性肿瘤的转移。当表皮生长因子(EGF)与EGFR结合后，主要是活化酪氨酸激酶，进而将EGFR的刺激信号传到核内，对细胞的生长和分化产生调节作用[5]。(2)分子学水平方面，由HHV8编码的潜伏期相关核抗原(LANA)，可在所有KSHV相关恶性肿瘤的肿瘤细胞中表达;LANA能与肿瘤抑制蛋白P53作用来抑制P53基因的转录活性，是肿瘤转化作用中的很重要的转录因子，而皮肤癌P53基因突变较为普遍，该基因异常与皮肤癌的发生，发展密切相关，当然也包括鳞状细胞癌[6]。(3)皮肤组织中环氧化酶2(COX2)和缺氧诱导因子1α(HIF1α)高表达对肿瘤的发生发展和转移的影响。恶性肿瘤的生物学特征之一就是生长迅速，随着实体肿瘤的增大，肿瘤内部不能得到足够的血液供应，导致局部处于缺血缺氧状态，因此必须有新生毛细血管形成供以营养，运输代谢产物，维持肿瘤生长发展的适宜环境。研究表明，COX2可通过多种机制来促进肿瘤新生血管的形成，同时缺氧可诱导HIF1α的表达，HIF1α又可上调COX2的表达，COX2又可通过其催化产物前列腺素2 (PGE2)激活HIF1α活性[7]，从而形成一个正反馈网络，共同促进肿瘤血管的生成，Koukourakis等[8]报道HIF1α高表达，可促进肿瘤血管新生，同时与SCC 的生长、浸润或转移密切相关。赵丽等[9]通过免疫组化结果显示，SCC组织中H IF1α与COX2的表达相关，提示二者在SCC的血管生成和肿瘤发生发展中可能起协同作用。(4)此外，可能的因素包括病毒致癌产物、病毒基因整合，以及通过与日光、局部免疫状态间的相互作用而导致皮肤鳞状细胞癌的发生。HHV8是否在新疆皮肤鳞状细胞癌发生发展中起一定的作用，此病毒的感染是发生在鳞状细胞癌皮损出现之前，还是由于发生鳞癌后局部免疫状态异常继发HHV8的进一步感染，另外，新疆特殊地理位置环境也可能是重要原因之一，因此，需要更多的皮肤鳞状细胞癌和非皮肤部位鳞状细胞癌的样本量及其它方法进一步的研究，以确定HHV8与鳞状细胞癌发病是否具有相关性。

　　【参考文献】

　　[1]Chang Y, Cesarman E, Pessin MS, et al. Identification of herpes virus like DNA sequences in AIDS associated kaposi's sarcoma[J]. Science, 1994,266(5192):1865 1869.

　　[2]Rady PL, Aarons S, Murray D, et al . Herpesviruslike DNA sequences in nonkaposi’s sar coma skin lesions of transplant patients[J]. Lancet, 1995, 345 339.

　　[3]Boshoff C, Yeo WS, Lubyova B, et al. HHV8 and skin cancers in immunosuppressed patients[J]. Lancet, 1996, 347338.

　　[4]杜文慧, 陈国, 孙荷, 等. 新疆地区普通人群中人疱疹病毒8型IgG抗体的调查报告[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2000,14(1):4446.

　　[5]Fisher DA, Lakshmanan J. Metabolism and effects of epidermal growth factor and related growth factors in mammals[J]. Endocr Rev, 1990,11(3):418442.

　　[6]邱莹, 李建峰, 齐敦魁. 皮肤鳞状细胞癌P53基因突变研究[J]. 临床及实验研究, 1998,20(4):12.

　　[7]Liu XH, Kirschenbaum A, Lu M, et al. Prostaglandin E2induces hypoxiainducible factor 1α stabilization and nuclear localization in a human prostate cancer cell line[J]. J Biol Chem, 2002,277(51):5081.

　　[8]Koukourakis MI, Giatromanolaki A, Sivridis E, et al. Hypoxiainducible factor (HIF1A and HIF2A), angiogenesis, and chemoradiotherapy outcome of squamous cell head and neck cancer[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2002,53(5):11921202.

　　[9]赵丽, 刘林潘, 皮肤癌组织中环氧合酶2和缺氧诱导因子1a的表达及微血管密度测定[J]. 郑州大学学报(医学版), 2008,43(2):210212.