转化生长因子β1在皮肌炎皮肤组织中的表达

　　作者：于华平,谢军　　作者单位：四川，安岳县第二人民医院皮肤科;四川省人民医院皮肤科

　　【摘要】目的探讨转化生化因子β1(Transforming growth factor- beta TGF-β1)在皮肌炎发病过程中的可能作用和相关临床意义。方法 18例皮肌炎患者活检皮肤组织(DM组)和17例正常活检皮肤组织(正常组)应用免疫组织化学LsAB法测定TGF-β1，对两组TGF-β1表达含量进行比较。结果 TGF-β1阳性颗粒定位在皮肤组织细胞的胞浆内和胞膜上;在DM组皮肤组织上的TGF-β1表达量显著高于正常组(P<0.05);在肺X线片上，DM患者中有11例肺纹理增多、增粗或纤维化，其TGF-β1分别高于无肺纹理增多、增粗或纤维化的患者和健康对照组(P<0.05)。结论 TGF-β1可能参与皮肌炎的整个发病过程。

　　【关键词】 皮肌炎;免疫组织化学;转化生长因子-β1

　　Abstract Objective To study the possible role of TGF-β1 in the pathogenesis of dermatomyositis and the correlated clinical significance.Methods LsAB was applied in detecting the expressions of TGF-β1 in the biopsy dermal tissues of 18 cases with dermatomyositis and in the biopsy tissues of 17 normal controllers , and the expressions of TGF-β1 in the 2 groups were compared. Result The positive granules of TGF-β1 were locatied in cytoplasm and cytomembrane; the expression of TGF-β1 in dermal tissue of the cases with dermatomyositis was much strong than that in normal control (P<0.000); the lung X-rays of 11 cases with dermatomyositis showed out lung infiltration and fibrosis with a stronger expression of TGF-β1 than those cases with no infiltration and fibrosis and the normal control (P<0.05).Conclusions TGF-β1 may play a certain role in the whole pathogenesis of dermatomyositis.

　　KEYWORDS dermatomyositis immunohistochemistry TGF-β1

　　皮肌炎(Dermatomyositis DM)/多发性肌炎(PM)是以皮肤和/或肌肉炎症为主的一种自身免疫性疾病。目前认为自身免疫性疾病与Th细胞亚群失衡，Th细胞功能性极化异常有关。转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)超家族是一类具有自分泌、旁分泌作用，被认为是引起器官纤维化的重要细胞因子[1] 。

　　我们采用免疫组织化学LsAB法检测18例DM患者皮肤损害中TGF-β1的表达情况，探讨其与DM分类和病程之间的关系，从而为阐明DM的发病机制和临床治疗提供参考依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 病例选择

　　DM 18例，均符合1975年Bohan和Peter的DM/PM诊断标准，其中男8例，女10例，年龄32-71岁，平均51.0岁;病期1个月至2年，中位数8个月。所有患者均处于活动期(血沉增快、血清肌酶增高，肌无力或/和肌压痛)。健康对照组17例，男8例。女9例，年龄20-62岁。平均34.8岁。

　　1.2 实验方法

　　实验均采用免疫组织化学链酶亲和素-生物素法(SP/Ls-AB法，Streptavidin peroxidase/Labeled streptAvidin-Biotin method)。TGF-fll检测免疫组化实验步骤：(1)常规脱蜡、水化、3%H202阻断内源性过氧化物酶;(2)高压锅抗原修复;(3)封闭细胞Fc受体：1:200非免疫羊血清封闭切片，置37℃孵箱中孵育15 min，用吸水纸吸去多余血清(不洗);(4)滴加一抗(1：200羊抗人IgG型TGF-fll抗体),室温过夜孵育后,PBS液洗5min×2次;(5)滴加二抗:滴加生物素标记的IgG型马抗羊抗体，37℃孵育40 rain，PBS洗5 min×2次;(6)滴加三抗：滴加过氧化物酶标记的链亲合素，37℃孵育40 min，PBS液洗5 min×2次;(7)DAB显色：滴加DAB液镜下观察适时终止(显色时间约2 rain左右);(8)常规苏木素复染、2%盐酸酒精分化、返蓝、脱水、透明、中性树胶封片。阴性对照为正常皮肤组织，空白对照为PBS代替一抗。免疫组化阳性细胞定量方法：所有组织切片均由两位有经验的病理医师在普通光镜下双盲法读片，观察判断TGF-fll抗体在SD和正常皮肤切片组织上的表达定位。采用Nikon Eclipss E600型全自动图象分析系统和Image-proplus 4.1.0.9图象分析软件进行定量分析，随机选取每张切片5个视野(10×40倍)测定阳性细胞的吸光值(A值)及面积，以两者乘积表示组织中该抗原相对含量，乘积越大表示抗原含量越高。

　　1.3 统计学处理

　　用SPSS11.0统计软件进行分析，当资料服从正态分布或总体方差齐时，采用t检验或方差分析;当资料不服从正态分布或总体方差不齐时采用t检验或Wilcoxon秩和检验。TGF-β1表达定量与ANA滴度采用直线相关或Spearman等级相关分析。显著性检验水平α=0.05，当P<0.05时，差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 TGF-β1阳性颗粒定位于基底细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、皮脂腺上皮细胞、汗腺上皮细胞等细胞内的胞浆内和胞膜上，基质和胶原没有表达。TGF-β1在正常皮肤组织的表皮和真皮表达信号较弱，在基底细胞层表达信号稍强;在DM皮肤组织的表皮、基底细胞层和真皮呈强阳性表达。在正常组和DM组空白对照的皮肤组织上表达均阴性。GF-β1在正常皮肤组织基底细胞层表达;图2 TGF-β1在DM皮肤组织表皮、基底细胞层和真皮表达

　　2.2 TGF-β1在DM组和正常组皮肤组织上定量表达比较。在DM组中TGF-β1表达量为1558.05±1212.95;在正常组中TGF-β1表达量为345.26±190.54;采用Wilooxon秩和检验法，两者比较有统计学意义(t=86，P=0.000)

　　2.3 TGF-β1肺纤维化DM18例做了肺X线摄片。结果DM11例示肺纹理增多、增粗或纤维化，其平均TGF-β1为(319.16±99.25)ng/mL;另7例中心肺无异常4例，肺癌、胸膜增厚和胸腔积液各1例，其平均TGF-β1(237.83+149.05)ng/mL;前者的TGF-β1分别高于后者(t=1.541，P>0.05，分析可能与例数偏少有关)和对照组(t=2.510，P<0.02);后者与对照组相比，差异无显著性(t=0.134，P>0.5)。

　　3 讨 论

　　皮肌炎是一种累及皮肤和内脏器官的结缔组织病，特点是外周血管和内脏脉管系统的纤维性硬化，皮肤和内脏有不同程度的细胞外基质(主要是胶原纤维)沉积。该病与某些特异性抗体如抗着丝点抗体、抗Scl-70抗体相关，其中TGF-β作为一种细胞因子参与该病的发病。TGF-β超家族是一类具有自分泌、旁分泌作用，被认为是引起器官纤维化的重要细胞因子，其来源广泛，具有免疫调节、胚胎发育、细胞分化、细胞外基质形成、血细胞及血管生成等多种作用[2]。TGF-β可使成纤维细胞分泌胶原增加，同时引起微血管结构和反应性异常，导致皮肤和内脏的纤维化。在炎症早期TGF-β具有免疫刺激功能，可聚集炎症细胞;在炎症中后期具有免疫抑制活性[3]。TGF-β在体内能直接刺激血管内皮细胞及血管生成，各种亚型的TGF-β适当表达是维持正常胚胎发育不可缺少的[4] 。

　　TGF-β1在DM的致病作用与真皮、内脏病理性纤维化有关。小剂量有化学趋化性和致炎作用;高浓度可促进创伤愈合和纤维化，引起纤维母细胞迁移，抑制胶原酶和其它金属蛋白酶的产生，增加胶原产生，降低胶原降解，促进基质沉积。作者检测TGF-β1在DM皮肤上表达量是正常对照组的3倍，与检索文献结果是一致的，表明TGF-β1与DM的发病密切相关。本研究显示DM患者分泌TGF-β1的水平增高，而既往研究表明DM患者Th3细胞极化增强。提示TGF-β1可能参与DM患者的免疫调节反应。Shull等[5] 发现敲除了TGF-β1基因的鼠可产生多个器官的炎症。McKarns等[6]发现高浓度的TGF-β1能抑制淋巴细胞产生IL-2，减轻炎症反应。说明TGF-β1对免疫反应有负调节作用。因此，DM患者TGF-β1的水平增高可能对抑制免疫反应、减轻组织器官的炎症具有一定的意义。DM患者常伴有组织器官的损伤，尤其是肺纤维化。本组X线片上有肺纹理增多、增粗或纤维化的患者，其TGF-β1增高，分别高于对照组和无肺纹理增多、增粗或纤维化的患者。分析可能与TGF-β1具促进成纤维细胞增殖，致纤维化有关。

　　【参考文献】

　　[1] Ihn H.Pathogenesis of fibrosis：role of TGF-[beta]and CTGF[J].CurOpinion Rheumatol，2002,14(6):681-685.

　　[2] Schuster N，Krieglstein K.Mechanisms of TGF.beta.mediated apoptosis[J].Cell～ssucRes，2002,307(1):11-14.

　　[3] Palmer EM，Beilfuss BA，Nagai T，et al.Human helper T cell activation and differentiation is suppressed by porcine maall intestinal submucosa[J].Ann Int Eng，2002,8(5):893-900.

　　[4] ParadisH，LiuCY，SaikaS，et al.Tubedown-1 in remodeling of the developing vitreal vasculature in vivo and regulation of capillary outgrowth in vitro[J].D Biol，2002,249(1):140-155.

　　[5] Shull MM,Ormsby I,Kier AB,et al.Targeted disruption of the mouse transforming growth factor beta l gene results in multifocal inflammatory disease[J].Nature，l992，359(5):693-699.

　　[6] McKams SC.Kaminski NE.TGF.beta l differentiallv regulates IL-2 expression and 3 HI-thymidine incorporation in CD3 epsilon mAband CD28 mAb.activated splenocytes and thymocytes[J].Immunopharmacology.2000,48(7):l0l-l15.