尖锐湿疣组织HPV6b和11型L1基因多态性及蛋白特性分析

　　作者：欧琴,石朝辉,朱珊丽,张丽芳　　作者单位：郧阳医学院 微生物学教研室，湖北 十堰 442000

　　【摘要】目的:调查温州地区尖锐湿疣组织HPV6b和11型感染情况，分析其L1基因多态性及蛋白特性变化，为基因工程重组L1蛋白疫苗的应用提供理论依据。方法:采用HPV6b和11型L1基因特异性引物对31份温州地区尖锐湿疣组织标本进行PCR扩增，并各取7份阳性PCR产物直接测序，用软件分析HPV6b和11型L1基因多态性及蛋白特性。结果:31份标本中，HPV6b和11型阳性率分别为35.5%和45.2%。与标准基因序列比较，HPV6b和11型L1基因分别形成5和6种突变模式，同源性分别为99.8%～99.9%和99.7%～99.9%。HPV6b型L1基因中仅1处碱基突变引起所编码氨基酸的变异(S→P)，但其编码蛋白在亲水性、表面可及性及抗原性上无明显变化;HPV11型L1基因的碱基突变均为无义突变，所编码氨基酸与标准株完全一致。结论:HPV6b和11型是温州地区尖锐湿疣的主要感染型别;HPV6b和11型L1基因序列高度保守。

　　【关键词】 人乳头瘤病毒;尖锐湿疣;L1基因;突变;基因多态性

　　Analysis of L1 gene polymorphism and L1 protein property of HPV 6b and 11 types in condyloma acuminatum OU Qin*，SHI Zhao-hui，ZHU Shan-li，ZHANG Li-fang. *Department of Microbiology，Yunyang Medical College，Shiyan，442000

　　Abstract: Objective: To study the viral types of Human Papillomavirus (HPV) in condylomata acuminate from Wenzhou area，and to analyze the changes of L1 gene polymorphism and protein property.Methods: The tissue DNA was extracted from 31 biopsy specimens of condylomata acuminate. The L1 gene of HPV was amplified with PCR by 6b and 11 type specific primers respectively. And seven positive L1 PCR products of each type were identified by sequencing.At last， it was L1 gene polymorphism and protein property that were analysied by biosoft. Results: The results of PCR showed that the positive rate of HPV6b and 11 L1 were 35.5 % and 45.2% respectively. Compared with standerd L1 gene sequence， five mutations were found and gene homology were 99.8%～99.9% in HPV6b type，six mutations were found and gene homology were 99.7%～99.9% in HPV11 type.The gene mutation of HPV6b L1 from S to P formed the change at nucleic acid level，but there was no significant difference in hydrophilicity，surface probality and antigencity. And the gene mutations of HPV11 L1 were all nonsense. Conclusion: HPV6b and 11 are the main infected types in the Wenzhou area， and the L1 gene sequence of HPV6b and 11 is highly conservative.

　　Key words: human papillomavirus;condylomata acuminate;L1 genes;mutation;gene polymorphism

　　尖锐湿疣(condylomata acuminata，CA)主要由人乳头瘤病毒( human papillomavirus，HPV) 6型和11型经性传播感染引起[1]。HPV L1基因可在杆状病毒-昆虫细胞系统中自行组装成病毒样颗粒(VLPs)，这种不含病毒DNA的空衣壳具有较强的抗原性和免疫原性，可刺激B细胞产生中和抗体，阻断病毒感染，因而L1蛋白成为了基因工程疫苗研究的重要靶抗原。在目前已分离的100多个HPV型别中，其感染型别往往存在地区差异[2]。本研究对温州地区CA组织标本进行了HPV6型和11型的型别鉴定及其L1基因序列全长测定，并对其基因多态性及蛋白特性进行分析，为基因工程重组HPV L1蛋白疫苗的应用提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本 31份CA组织标本来源于温州医学院第二附属医院皮肤科就诊的患者，均经临床和病理诊断确诊为CA。每份标本均无菌切取病变组织，-80℃保存备用。

　　1.2 主要试剂 PCR试剂及λDNA/Hind Ⅲ DNA marker购于上海晶美生物工程有限公司，动物组织DNA提取浓缩试剂盒购于大连TaKaRa公司，PCR清洁试剂盒购于杭州维特洁生化技术有限公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 标本DNA的提取及PCR引物的设计：按试剂盒说明书操作提取CA组织标本DNA。以GENEBANK中报道的HPV6b(收录号为NC 001355)和HPV11(收录号为M 14119)L1基因序列为标准序列，共设计8条引物(见表1)，分别用于PCR扩增L1完整开放读码框和基因序列测定。引物由北京三博生物技术有限公司合成。

　　1.3.2 HPV L1基因扩增及型别鉴定：以所提标本DNA为模板，分别用HPV6b和11型特异性引物行PCR扩增。扩增参数为：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.3.3 HPV L1基因序列测定及蛋白特性分析：PCR产物经PCR清洁试剂盒纯化，由北京三博远志生物技术有限公司用特异性引物进行L1基因全长序列测定。用Vector NTI 8.0和DNAStar软件对测序结果进行序列分析。

　　2 结果

　　2.1 HPV6b、11型特异性引物PCR扩增检测结果 PCR产物琼脂糖凝胶电泳，可见一约为1 500 bp的扩增条带，其大小与预计相符。31份标本中HPV6b和11型DNA阳性检出率为74.2%(23/31)，其中HPV6b L1 DNA阳性率为35.5%(11/31)，HPV11 L1阳性率为45.2%(14/31)，HPV6b L1+HPV11 L1阳性率为6.5% (2/31)。

　　2.2 HPV6b和11 L1基因全长序列测定及同源性分析 分别取7份HPV6b和11 L1 PCR产物纯化后行全序列测定。与标准基因序列比较，用Vector NTI 8.0软件分析基因多态性;用DNAstar软件进行同源性分析。

　　2.3 HPV6b和11 L1蛋白氨基酸一级结构分析 与标准氨基酸序列比较，用DNAstar软件进行L1蛋白氨基酸变异分析。结果显示，仅1例标本的HPV6b L1基因其第7250处碱基发生突变，其编码的氨基酸由丝氨酸(S)→脯氨酸(P)，为地方株;而HPV11 L1蛋白氨基酸均未发生变异。

　　2.4 地方株HPV6b L1蛋白亲水性、表面可及性和抗原性分析 用DNAstar软件对地方株HPV6b L1蛋白进行分析，并与标准株比对进行分析。地方株L1蛋白在亲水性上无任何改变，氨基酸序列第488～500肽段出现了一个表面可及性增强区，第52～66肽段、256～282肽段、391～400肽段和466～500肽段抗原性增强，第143～151肽段和445～464肽段抗原性减弱。

　　3 讨论

　　2006年6月，美国食品与药物管理局(FDA)宣布，世界上首个由HPV6、11、16和18型VLPs组成的四价HPV基因工程疫苗，即Gardasil疫苗已获批准在美国上市，可用于预防HPV6、11、16和18型所引起的生殖器疣、癌前病变及宫颈癌[3]。这为预防CA带来了希望，但HPV感染型别存在一定的地域差异[2]。本研究检测的31份CA标本中，HPV6b和11型的DNA总阳性率为67.7%(21/31)，分别为35.5%、45.2%;HPV6b L1+HPV11 L1的阳性率为6.5%，表明温州地区CA的HPV感染以HPV6b和11型为主。Christensen等[4]报道了美国费城65例CA标本HPV6b和11型DNA阳性率为96.9%(63/65)。Abba等[5]报道阿根廷拉普拉塔市100份CA标本中，HPV的阳性率为86%，其中HPV6、11为主要型别。Grce等[6]报道了欧洲克罗地亚地区168份CA标本中以HPV6b型感染为主。国内有关CA 的HPV感染型别研究报道较多。洪少林等[7]检测的北京地区110份CA标本中，HPV6的阳性率为60%，HPV11的阳性率为24.5%，两者的混合阳性率为10%，其它型别的阳性率为5.5%。蒋明军等[8]报道北京地区201份CA标本中HPV6和11的阳性率分别为45.8%和56.2%。史庭燕等[9]报道南京地区50份CA标本中，HPV6型阳性率为40%，HPV11型阳性率为48%，HPV6和HPV11型混合阳性率为6%。孙爱华等[10]检测的107份杭州地区CA标本中，HPV6型阳性率为70.1%，HPV11型阳性率为23.4%，HPV6和HPV11型混合阳性率为6.5%。以上研究表明，引起CA的HPV感染型别虽然因地区和人群有一定差异[3]，但均以HPV6和11型感染为主。

　　分析HPV6b和11型L1基因序列变异和氨基酸序列改变，掌握代表型抗原性基因的变化是发展基因工程疫苗的重要环节。本研究检测的HPV6b L1与标准株比较，在基因水平上形成5种突变模式，分别位于第5929(1/7)、6256(1/7)、6598(7/7)、7099(4/7)和7250(1/7)位，且在第6598位均发生突变，是突变的主流型，除第7250位突变(S→P)外，均为同义突变。表明来自不同标本的HPV6b型L1基因点突变发生较为广泛，但多位于密码子第3位，未影响氨基酸的改变。而地方株HPV6b L1的第488位氨基酸虽由丝氨酸变为脯氨酸，即羟基类氨基酸变为亚氨基酸，但其亲水性无任何改变，表面可及性及抗原性强弱也基本一致。洪少林等[7]人报道CA患者感染的HPV6b L1多态性分析，发现26处变异，多为同义突变，其第6598和7099位碱基突变为主要的突变模式;Icenogle等[11]人曾报道对美国和菲律宾两地分离的HPV6 L1的基因序列进行分析，发现基因突变位点位于其基因的第6598、6625、6661位，且所有标本的第6598位均发生了突变，表明在第6598位基因突变发生较为广泛;Wanderley等[12]对伦敦地区17例HPV6b临床检测的L1序列分析，报道的变异高发区位第5920～6075位、第6590～6670位、第7070～7230位。与本研究结果基本一致。

　　本研究HPV11 L1基因序列与标准株比较，在基因水平形成了6种突变模式，分别位于第6028(7/7)、6214(1/7)、6514(2/7)、6589(1/7)、6607(7/7)和7045(2/7)位，同源性为99.7%～99.9%，但6种突变模式并没有影响到氨基酸序列改变，均属同义突变，与国内2005年报道的东北地区HPV11 L1基因突变模式一致[13]，表明HPV11 L1基因具有高度保守的特点。

　　本实验表明HPV6b和11型是温州地区尖锐湿疣的主要感染型别，且其L1基因序列高度保守。因此，基于L1基因制备的基因工程疫苗可适用于温州地区HPV感染的预防。

　　【参考文献】

　　[1] Pisani P,Parkin DM,Bray F,et al. Estimates of the worldwidemortality from 25 cancers in 1990[J]. Int J Cancer, 1999, 83 (1):18-29.

　　[2] Clifford GM, Rana RK, Franceschi S,et al.Humanpapillomavirus genotype distribution in low-grade cervicallesions: comparison by geographic region and with cervicalcancer[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2005,14(5):1157-1164.

　　[3] Boyle P,Ferlay J.Cancer incidence and mortality in Europe,2004[J].Ann Oncol,2005,16(3):481-488.

　　[4] Christensen ND,Reed CA,Cladel NM,et al. Monoclonal anti-bodies to HPV-6 L1 virus-like particles identify conforma-tional and linear neutralizing epitopes on HPV-11 in additionto type-specific epitopes on HPV-6[J]. Virology, 1996,224 (2):477-486.

　　[5] Abba MC,Gomez MA,Golijow CD.Human papillomavirusgenotype distribution in cervical infections among woman inLa Plata, Argentina[J]. Rev Argent Microbiol,2003,35(2): 74-79.

　　[6] Grce M, Husnjak K, Skerlev M, et al. Detection and typing ofhuman papillomaviruses by means of polymerase chain reac-tion and fragment length polymorphism in male genital le-sions[J]. Anticancer Res, 2000,20(3B):2097-2102.

　　[7] 洪少林,王家璧,李平川,等.尖锐湿疣病变的人乳头瘤病毒6型L1序列多态性分析[J].病毒学报，2002,18(2):102-107.

　　[8] 蒋明军,王书崎,龚向东,等.尖锐湿疣皮损中人乳头瘤病毒基因分型研究[J].中华皮肤科杂志,2005,38(5):262-264.

　　[9] 史庭燕,赵秀丽,施燕峰,等. 应用树突状DNA杂交(DDH)对生殖道尖锐湿疣中HPV DNA的分型和检测[J].病毒学报，2004,20:12-16.

　　[10] 孙爱华,徐莹,冯燕,等. 尖锐湿疣组织中人乳头瘤病毒6和11型的感染率及其L1基因的表达[J].中华流行病学杂志,2006，27(2):150-153.

　　[11]Icenogle JP, Sathya P, Miller DL,et al.Nucleotide and aminoacid sequence variation in the L1 and E7 open reading framesof human papillomavirus type 6 and type 16[J]. Virology,1991,184(1):101-107.

　　[12]Caparros-Wanderley W,Savage N,Hill-Perkins M,et al.Intratype sequence variation among clinical isolates of thehuman papillomavirus type 6 L1 ORF:Clustering of muta? tions and identification of a frequent amino acid sequencevariant[J]. J Gen Virol,1999,80(Pt 4):1025-1033.

　　[13]庄敏,谷鸿喜,魏兰兰,等.尖锐湿疣组织中HPV型别检测及HPV11型L1基因的克隆与测序[J].中国皮肤性病学杂志,2005,19(9):519-521.