系统性红斑狼疮患者CD4+、CD8+T淋巴细胞SLAM基因的

　　作者：游弋,郝飞,邓永键　　　作者单位：第三军医大学西南医院皮肤科,重庆市皮肤性病研究所,重庆

　　摘　要:目的　探讨系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)患者CD4+、CD8+T淋巴细胞SLAM基因的表达。方法　采用免疫磁珠的方法对20例系统性红斑狼疮患者及10例正常人外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞进行分离,

　　RT-PCR对CD4+、CD8+T淋巴细胞SLAM基因表达进行分析。结果　SLE患者CD4+、CD8+T淋巴细胞SLAM mRNA表达增加显著高于正常对照。结论　SLAM介导的T淋巴信号通路转导异常可能在SLE患者T淋巴细胞激活异常中发挥重要的作用。

　　关键词:红斑狼疮,系统性;信号转导淋巴细胞激活分子

　　中图法分类号:R392. 12;R392. 13;R593. 24　　　文献标识码:A

　　Expression of SLAM gene in CD4+and CD8+T cells from SLE patients YOU Yi,HAO Fei,DENG Yong-jian(Department of Dermatology,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

　　Abstract:Objective　To explore the expression ofSLAM gene in the CD4+and CD8+T cells from SLE

　　patients.Method　TheCD4+and CD8+T cells from peripheralblood of20 SLE patients and 10 healthy blood

　　donorswere separated usingmagnetic cellsorting system(MACS). We detected the expression ofSLAMmRNA

　　in CD4+and CD8+T cellsbyRT-PCR.Results　TheCD4+and CD8+T cells from SLE patients showed sig-nificantly higherSLAM expression than those from healthy blood donors.Conclusion　The SLAM ignalpathwaymay play an important role in contributing to the abnormal activation ofT cells in SLE patients.

　　Key words:lupus erythematosus;systemic;SLAM

　　系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种典型的多器官损害的自身免疫性疾病,以机体产生大量的致病性自身抗体为主要特征。免疫系统的异常是SLE重要的发病机制,而T淋巴细胞的异常活化在其中发挥重要的作用[1, 2]。为了研究SLE患者不同活动状态下T淋巴细胞异常活化中基因表达的差异,本课题组前期实验采用LongSAGE技术,构建SLE患者CD4+、CD8+T淋巴细胞表达差异的表达基因谱,并对表达基因进行聚类分析,结果显示信号转导淋巴细胞激活分子( signaling lymphocytic activation molecule, SLAM)在SLE患者活动期外周血CD4+T淋巴细胞中表达明显高于静止期[3]。为此,我们收集了20例SLE患者及10例正常对照,对SLAM基因的mRNA进行检测,旨在进一步验证前期研究结果。

　　1　材料与方法

　　1. 1　研究对象

　　20名SLE患者,女性,年龄(34. 5±13. 0)岁,分别为本院皮肤科、肾内科、新桥医院肾内科、重庆医科大学第一附属医院皮肤科的住院患者,诊断均符合美国风湿病学会1997年推荐的SLE分类标准。采血前对其血常规、尿常规、肝功、肾功、血沉、24 h尿蛋白定量、血沉、补体C3、C4、抗核抗体(ANA)、核抗原抗体(ENA)、抗双链DNA抗体(ds-DNA)进行检测。根据SLEDAI-2K[4]对其疾病活动度进行评分。其中基本无活动或轻度活动的SLE患者11例(SLEDAI<10),年龄(35. 2±16•4)岁,中度及重度SLE患者9例(SLEDAI≥10),年龄(33. 8±8. 1)岁。未经治疗的SLE患者7例,年龄(31. 3±12. 4)岁,经过强的松及细胞毒性药物治疗的SLE患者13例,年龄(36. 3±13. 5)岁。10名正常对照均为女性,年龄(32. 4±8. 5)岁,均为本院输血科健康献血者,其血常规、尿常规、肝功、肾功、ANA等检测均正常。20例SLE患者与10例正常对照者的年龄无显著性差异(P>0•05)

　　1. 2　主要仪器及试剂

　　1. 2. 1　主要仪器　　VarioMACS(Mitenyi Biotec)、Ms separation columns(Miltenyi Biotec)、流式细胞分析仪(Becton Dickinson)、PCR热循环仪(Applied Biosystems公司)、凝胶电泳扫描仪(Bio-Rad公司)、紫外分光光度计(Nanadrop-1000)。

　　1. 2. 2　主要试剂　　人淋巴细胞分离液(天津中国医学科学院生物医学工程研究所)、Human CD4 FITC conjugated(DIA-CLONE SAS)、Human CD8 FITC conjugated(DIACLONE SAS)、Anti-FITC Microbeads (Miltenyi Biotec)、Tripure分离试剂(Roche)、AMV逆转录酶(TaKaRa)、核酸酶抑制剂(TaKaRa)、ExTaq(TaKaRa)。PCR引物由Primer Premier 5. 0设计,并由北京奥科公司合成。

　　1. 3　方法

　　1. 3. 1　细胞分离及流式细胞仪分析[5]　　SLE患者及正常对照均抽取20 ml静脉血,Ficoll梯度离心法分离外周血单个核细胞,将分离液均分两管,分别加入Anti-CD4-FITC及Anti-CD8-FITC及等量Anti-FITCMicrobeads,行免疫磁珠法分离,结果分别用流式细胞仪分析其分离纯度。

　　1. 3. 2　RNA提取　　按Tripure试剂盒说明书的步骤抽提细胞总RNA,并用紫外分光光度计对其进行定量分析,D(260) /D(280)均在1. 7~2. 0。

　　1. 3. 3　逆转录反应　　以1μgRNA为模板,以Oligod(T)18为引物,在20μl反应体系内,加入5×buffer 4μ,l dNTP20 mmol/L,AMV逆转录酶10 U,RNase抑制剂20 U于42℃进行逆转录反应。99℃水浴5 min,置4℃保存。

　　1. 3. 4　PCR反应　　SLAM基因上游: 5′-ACACCAGAGAC-CAACAAAGGGACT-3′,下游: 5′-CTGCTACAACACAAAGATG-GAACG-3′,目的片段: 270 bp。β-actin基因上游: 5′-CGTGGA-CATCCGCAAAGAC-3′,下游: 5′-CTCGCTCCAACCGACTGCT-3′,目的片段: 455 bp。PCR反应条件, SLAM: 95℃2 min, 94℃20 s, 57℃45 s, 72℃25 s, 35个循环;β-actin: 95℃2 min,94℃20 s, 57℃45 s, 72℃30 s, 30个循环。

　　1. 4　统计学方法

　　采用QuantityOne软件对电泳结果进行分析,以SLAM /β-actin值表示SLAM基因的表达强度。各组所得比值采用SPSS10. 0统计软件进行单因素方差分析。

　　2　结果

　　2. 1　流式细胞仪分析结果

　　流式细胞分析结果提示所有分离的CD4+及CD8+T淋巴细胞纯度达到90%以上。见图1。

　　A:CD4+T淋巴细胞;B:CD8+T淋巴细胞

　　图1　SLE患者分离CD4+、CD8+T淋巴细胞流式细胞分析结果

　　2. 2　SLE患者CD4+、CD8+T淋巴细胞SLAM基因的表达

　　图2为8例SLE患者SLAM及内参基因PCR电泳图,经统计学处理,结果见表2。SLE患者CD4+及CD8+T淋巴细胞SLAM mRNA表达均高于正常对照(P值分别为0. 028、0•034),且中重度活动SLE患者CD4+T淋巴细胞SLAM mRNA的表达显著高于轻度SLE患者(P=0. 014)。

　　M:DNA标准(DL 2000);1-8:CD4+T淋巴细胞SLAM基因

　　图2　SLE患者CD4+T淋巴细胞SLAM、β-actin基因的表达

　　表1　SLE患者与正常对照组CD4+及CD8+T淋巴细胞SLAM

　　基因mRNA表达水平比较(-x±s)

　　组别nCD4+T淋巴细胞CD8+T淋巴细胞

　　正常对照10 0. 097 3±0. 080 8 0. 317 2±0. 272 7

　　SLE 20 4. 793 7±0. 637 2a0. 829 0±0. 693 8a

　　SLEDAI<10 11 2. 253 6±1. 034 4c0. 856 0±0. 810 7

　　SLEDAI≥10 9 7. 898 4±8. 682 5b0. 802 0±0. 597 8

　　a:P<0. 05,b:P<0. 01,与正常对照比较;c:P<0. 05,与SLEDAI≥10比较

　　3　讨论

　　SLAM家族是免疫细胞激活的重要协同刺激分子。该家族包括6个成员,分别为SLAM (CD150、SLAMF1)、2B4、CD84、NK、T及B细胞抗原(NTBA、SLAMF6,在小鼠中称为ly108)、ly9(CD229)及CD2样受体激活细胞毒细胞(CRACC、CD319),编码这些分子的基因均位于1号染色体。这些受体分子表达于各种免疫细胞中[6]。人SLAM基因于1993年首次被描述为IPO-3,Ma等[7]之后将其克隆。SLAM在人和小鼠中均主要表达于胸腺细胞、血小板、成熟的树突状细胞、幼稚B细胞、记忆T细胞,且在淋巴细胞体外刺激后表达增加。SLAM具有同型结合及协同刺激分子的功能,它通过细胞质端的酪氨酸基序与包含SH2结构域的适配子SAP(SLAM相关蛋白, SH2D1A)结合,SAP的SH2结合域再作用于蛋白酪氨酸激酶FYNT的SH3结合域,从而调节蛋白质酪氨酸磷酸化信号的转导。因此, SLAM对淋巴细胞的激活、细胞因子的分泌及免疫过程中Th1/Th2细胞的分化有重要的功能。抗-SLAM单抗通过激活CD4+T淋巴细胞和细胞毒性CD8+T淋巴细胞,能增加细胞增殖和细胞因子的分泌。SLAM缺乏的小鼠模型的CD4+T淋巴细胞IL-4、IL-13分泌减少,而IFN-γ表达轻度上升,表明SLAM在Th2细胞细胞因子分泌中起重要作用[8]。Fas基因缺乏的狼疮鼠模型(MRL-Faslpr)的研究发现,核苷酸插入可使SAP表达缺乏,导致这种模型发生突变,而且这种突变的小鼠几乎没有自身免疫疾病相关症状的表现[9]。此外,有研究还表明, SAP缺乏的小鼠狼疮相关体征的出现减少,包括产生高丙种球蛋白,抗dsDNA的自身抗体及肾脏的累及,这些均证实了SLAM-SAP信号转导系统在机体T细胞依赖的体液免疫调节中的特殊作用,提示SLAM-SAP参与了抗体诱导的自身免疫性疾病的发病[10]。

　　研究表明,类风湿性关节炎(RA)患者关节液中分离的T细胞和滑膜组织中SLAM的表达增加,同时RA患者的外周血单个核细胞的SLAM基因表达也增加;用抗-SLAM刺激滑膜单个核细胞, IL-10、IFN-γ、TNF-α的产生增加,这提示SLAM-SLAM的同型结合在T细胞和滑膜单个核细胞中能够通过改变细胞因子的分泌促进疾病的进展[11]。

　　SLAM是T细胞激活的协同刺激因子,我们前期的研究表明, SLAM在SLE患者活动期外周血CD4+T淋巴细胞中表达明显高于静止期[3]。本研究我们收集了20例SLE患者及10例正常对照,分离CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞,RT-PCR检测SLAM基因的表达,结果显示SLE患者CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞SLAM基因的表达显著高于正常对照,且中重度活动SLE患者CD4+T淋巴细胞SLAM基因的表达显著高于轻度SLE患者。我们的实验进一步证实了我们前期研究中的发现,并证实了SLAM基因在SLE患者活动期CD4+和CD8+T淋巴细胞中均高表达。协同刺激分子的异常是SLE发病机制中T细胞打破自身耐受的重要因素。有研究表明, SLE患者外周血T淋巴细胞中CD40L表达异常, LFA-1等协同刺激分子表达的异常也被发现[12]。本研究表明, SLAM基因的表达在SLE患者中明显增高,且表达量与疾病活动度呈正比,这提示在SLE患者中, SLAM基因介导的协同刺激信号转导可能存在异常,这种异常可能是SLE的发病机制之一。

　　参考文献:

　　[1] FujiiY, FujiiK, TanakaY. Attempt to correct abnormal signal transduction in T lymphocytes from systemic lupus erythematosus patients[J]. Autoimmun Rev, 2006, 5(2): 143-144.

　　[2]王惠琳,郝　飞,游　弋,等.γ干扰素诱导蛋白30基因在系统性红斑狼疮CD4+T淋巴细胞中的表达分析[ J].第三军医大学学报, 2006, 28(9): 919-921.

　　[3] DengY J, HuangZX, Zhou C J,etal. Gene profiling involved in immature CD4+T lymphocyte responsible for systemic lupus erythematosus[J]. Mol Immuno,l 2006, 43(9): 1497-1507.

　　[4] Gladman D D, IbanezD, UrowitzM B. Systemic lupus erythematosus disease activity index 2000[J]. JRheumato,l 2002, 29 (2): 288-291.

　　[5]游　弋,郝　飞,邓永键.免疫磁珠法检测系统性红斑狼疮患者外周血T淋巴细胞亚群及其意义[J].第三军医大学学报, 2005, 27(7): 649-651.

　　[6] VeilletteA, Cruz-MunozM E, ZhongM C. SLAM family receptors and SAP-related adaptors: matters arising[J]. Trends Immuno,l 2006, 27(5): 228-234.

　　[7] Ma C S, NicholsK E, Tangye SG. Regulation ofCellularand humoral immune responses by the SLAM and SAP families ofmolecules[ J].Annu Rev Immuno,l 2007, 25: 337-379.

　　[8] VeilletteA. Immune regulation by SLAM family receptors and SAP-related adaptors[J]. NatRev Immuno,l 2006, 6(1): 56-66.

　　[9] KomoriH, FurukawaH, MoriS,etal. A signaladaptorSLAM-associated protein regulates spontaneous autoimmunity and Fas-dependent lymphoproliferation inMRL-Faslpr lupusmice [J]. J Immuno,l 2006,176(1): 395-400.

　　[10] Hron JD, CaplanL, GerthA J,etal. SH2D1A regulatesT-dependent humoral autoimmunity[J]. JExpMed, 2004, 200(2): 261-266.

　　[11] Chan A Y, Westcott JM, Mooney JM,et al. The role of SAP and the SLAM family in autoimmunity[J]. CurrOpin Immuno,l 2006, 18(6): 656-664.

　　[12] HoffmanRW. T cells in the pathogenesis ofsystemic lupus erythematosus[J]. Clin Immuno,l 2004, 113(1): 4-13.