解脲脲原体ｅｒｍＢ基因与转座子遗传标记ｉｎｔ-Ｔｎ的相关

　　作者：陆春,叶庭路,朱国兴　　作者单位：中山大学附属第三医院皮肤性病科， 广东 广州 510630; 2. 广东省皮肤性病防治中心， 广东 广州

　　【摘要】 探讨解脲脲原体(Uu)临床株ermB耐药基因与接合转座子遗传标记int-Tn基因之间的关系。 【方法】 采用微量肉汤稀释法体外测定76株Uu对红霉素的最低抑菌浓度(MIC)，设计引物扩增ermB和int-Tn基因。 【结果】 Uu对红霉素MIC范围为 ≤ 0.125 ～ ≥ 128 μg/mL，MIC50为32 μg/mL，MIC90 ≥ 128 μg/mL，耐药率为78.95%。共21株Uu菌株检测到ermB基因，其中19株的MIC ≥ 8 μg/mL，2株的MIC = 4 μg/mL。21株Uu携带int-Tn基因，ermB基因与int-Tn基因之间有显著相关性。 【结论】 ermB基因可能是介导Uu对红霉素耐药的一种重要的基因，ermB与转座子遗传标记int-Tn基因密切相关。

　　【关键词】 解脲脲原体; 红霉素; ermB基因; 转座子

　　非淋菌性尿道炎和黏液脓性宫颈炎是目前最常见的性传播疾病之一，解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)与这两种疾病的发生密切相关，是目前性病防治工作热点病原体之一[1]。近年来文献报道Uu对大环内酯类耐药率已相当高[2]，给防治工作带来诸多困难。Uu对大环内酯类的耐药机制及相关的分子基础至今尚未完全清楚。研究提示Uu 23s RNA的点突变可以产生与细菌类似的对大环内酯类耐药[3]，但迄今未见其他耐药机制研究的报道。因此，开展这方面的研究对监测Uu耐药状况、指导临床治疗、加深对Uu耐药机制的认识以及探讨耐药机制的来源与传播，均有重要意义。ermB基因是介导对大环内酯类耐药的一种重要基因，其可能定位于转座子。我们检测临床分离的76株解脲脲原体ermB及int-Tn基因，并分析两者之间的关系，现将结果报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 研究对象

　　研究共收集76株Uu临床标本，均为2008年3月至5月期间在我科门诊就诊的尿道炎、宫颈炎患者或健康体检者的尿道或宫颈分泌物标本。Uu-3血清型标准株ATCC27815、Uu-8血清型标准株ATCC21618为本实验标准对照。

　　1.2 主要试剂

　　Uu液体培养基购自广州市怡林园生物工程有限公司，批号09050601。A7固体鉴定培养基购自法国梅里埃公司，批号784094601。红霉素标准品购自美国Sigma公司，批号2040401，实验前先用少量无水乙醇溶解，再用液体培养基将其稀释为512 ?滋g/mL。PCR反应试剂盒及DNA marker购自天根生化科技(北京)有限公司;DNA引物由美国Invitrogen(上海)英骏生物技术有限公司合成。琼脂糖购自广州威佳科技有限公司。

　　1.3 方 法

　　1.3.1 解脲脲原体的分离、纯化及鉴定

　　Uu标本以标准的方法收集后[4]，用A7固体培养基鉴定，待于低倍镜下观察有典型棕黑色海胆状细小菌落为Uu生长。挑取单个典型菌落重复接种于液体培养基增菌，增菌后菌液置于-20 ℃冰箱备用。

　　1.3.2 MIC的测定

　　采用微量肉汤稀释法进行[4]。红霉素的浓度范围为0.125 ～ 128 μg/mL。耐药结果的判断参考文献，即≥8 μg/mL为耐药，<8 μg/mL为敏感[4]。

　　1.3.3 PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳

　　菌株DNA提取参考文献[5]。PCR反应体系均为：20 μmol/L引物各1 μL，2.5 U/μL Taq酶0.5 μL，10 × PCR Buffer (含Mg2+) 5 μL，2.5 mmol/L dNTP混合物4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 36.5 μL，总反应体积50 μL。ermB基因引物：上游5′-GCAAATGGTGTA GGTAAGACAACT-3′，下游5′-ATCATGTGATGT AAACAAAAT-3′[6]，反应条件：94 ℃变性60 s，52 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环;int-Tn基因引物：上游5′-GCGTGATTGTATCTCACT-3′，下游5′-GACGCTCCTGTTGCTTCT-3′[7]，反应条件： 94 ℃变性60 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，其中ermB基因为639 bp，int-Tn基因为1 046 bp。将PCR产物直接送Invitrogen(上海)英骏生物技术有限公司纯化测序，测序结果在Blast (http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上比对证实。

　　1.4 统计学处理

　　ermB基因与int-Tn基因相关性分析采用卡方检验，双侧检验，显著性水准α = 0.05。所有数据均由The SAS System for Windows V8软件处理。

　　2 结 果

　　2.1 MIC结果

　　76 株Uu临床株中，MIC范围是 ≤ 0.125 ～ ≥ 128 μg/mL， MIC50为32 μg/mL，MIC90 ≥ 128 μg/mL。其中检测出60株耐药株，耐药率为78.95%。Uu血清型3、8标准株MIC分别为0.5、2 μg/mL。

　　2.2 ermB和int-Tn基因的PCR检测

　　图1、2分别为Uu ermB基因和int-Tn基因的PCR电泳图。PCR产物测序、比对证实均为两基因。检测到ermB基因、int-Tn基因阳性Uu均为 21株，阳性率均为28.38%。

　　2.3 ermB和int-Tn基因与耐药程度的关系

　　ermB阳性的21株Uu中，19株(90.48%)分布在对红霉素的MIC ≥ 8 μg/mL的Uu中，2株(9.52%) MIC为 4 μg/mL的Uu菌株，经多次PCR检测均发现其ermB基因阳性。21株携带int-Tn基因的Uu中，16株(90.48%)MIC ≥ 8 μg/mL，5株的MIC ≤ 4 μg/mL(表1)。

　　2.4 ermB与int-Tn基因的相关性

　　分析ermB基因与int-Tn基因之间的相关性发现，21株ermB基因阳性的Uu中，15株(71.43%)同时携带int-Tn基因，而21株int-Tn基因阳性Uu中，也有15株(71.43%)同时携带ermB基因。χ2检验分析发现两基因之间呈正相关性(表2;χ2 = 27.84， P < 0.001，相关系数r = 0.4679)。

　　3 讨 论

　　我们发现广州地区Uu临床株对红霉素的耐药率为78.95%，耐药形势也不容乐观，红霉素已不适合作为本地区的一线治疗药物。同时，除了继续加强对Uu对各种治疗药物的耐药性的监测及规范临床用药外，开展对Uu对大环内酯类耐药分子机制的研究也迫在眉睫。

　　目前有关Uu对大环内酯类耐药机制研究报道很少。在细菌，大环内酯类耐药的可能机制有药物靶位点改变、抗菌素灭活酶的产生、药物主动外排三种，而红霉素核糖体甲基化酶基因(erythromycin ribosome methylase，erm)介导的甲基化作用是一种十分常见的耐药机制[8]。erm基因目前已发现有A、B、C等多种亚型，编码产物能以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体，催化23SrRNA的单个腺嘌呤成为甲基或二甲基-腺嘌呤，从而影响23SrRNA中大环内酯类药物结合的空间结构，可引起对大环内酯-林可酰胺-链阳性菌素B型耐药(MSLB表型)。ermB基因介导的耐药水平范围较大，且介导的耐药水平与不同的菌属有关[9-10]。我们研究在Uu临床株中也发现了ermB基因，提示Uu对大环内酯类药物耐药机制与细菌也有一定的相似性，但相当部分菌株未发现该耐药基因，提示还可能存在其它的耐药机制。我们发现携带ermB基因的菌株中，90%出现在对红霉素的MIC ≥ 8 μg/mL的菌株中，但有2株MIC = 4 μg/mL，提示ermB基因在不同的微生物中可能介导不同的耐药水平。

　　研究提示，在多种细菌中ermB基因定位于转座子内(transposon， Tn)[11-12]。转座子是除了携带与移动作用有关的基因外，还携带有其他基因(如耐药基因)的一段可移动DNA 序列。可分为复合型转座子、Tn3 族转座子和接合型转座子。int-Tn基因是接合转座子Tn1545 及Tn916的整合酶基因，编码转座子整合到新位点所必需的整合酶， 是这些转座子的遗传标记[13]。国外研究发现，67%无乳链球菌携带int-Tn基因，国内学者也发现int-Tn基因在肺炎链球菌的阳性率为87.6%[9，14]，提示转座子普遍存在于细菌。通过分析ermB与int-Tn基因的相关性，可以推测ermB基因是否定位与转座子内[12-13]。我们的研究发现28.38%的Uu携带int-Tn基因，提示在Uu中，携带转座子也是比较多见的。分析Uu的int?鄄Tn与ermB基因相关性发现两者之间呈正相关，即ermB基因阳性的菌株，其int-Tn基因也倾向于阳性，提示在Uu，ermB基因也可能定位于转座子。但部分ermB基因阳性菌株未发现转座子，提示在Uu ermB基因还可能有其它的基因宿主。

　　在革兰阳性细菌中，转座子可在细菌不同种、属间进行接合转座，整合到受体染色体或质粒的不同位点上使抗生素的耐药得以扩散[12]。Uu寄生于尿道、阴道、宫颈等下生殖道黏膜，与这些部位寄生或感染的各种微生物可能处于共存状态，它们之间的密切接触为微生物之间耐药基因传递提供了可能条件。因此，Uu的耐药基因可能与其它细菌有共同的来源，并可能随着转座子的转座作用在微生物之间水平传递。

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