银屑病角质形成细胞凋亡与Fas/FasL表达的关系

　　作者：陈晋广 任小丽 作者单位：318000 浙江台州市立医院皮肤科

　　【摘要】 目的 探讨银屑病皮损中角质形成细胞(KC)凋亡与Fas/FasL表达的关系。 方法 免疫组化ABC法对银屑病患者皮损中Fas、FasL表达进行检测，TUNEL法检测皮损中KC凋亡情况。 结果 银屑病皮损中既可表达Fas，又可表达FasL,而在正常皮肤不表达;患者皮损中KC发生凋亡的比例明显高于正常对照组(P<0.01)，但病程的不同阶段其细胞凋亡指数(AI)不同，进行期高于静止期。 结论 KC凋亡参与了银屑病的发病过程，Fas、FasL对角质形成细胞凋亡有调节作用。

　　【关键词】 银屑病 角质形成细胞 细胞凋亡 Fas FasL

　　【Abstract】 Objective To study the relationship between keratinocyte(KC) apoptosis and expression of Fas/FasL in the lesions of psoriasis. Methods Apoptosis of KC were measured by TUNEL. Immunohistochemical technique-Avidin biotin comples (ABC) were employed to syudy the expression of Fas,FasL in the lesions of patients. Results Both Fas and FasL were expressed in the lesions , and no expressed in normal skin.The higher frequency of apoptosis KC was obseverd in progressive stage of psoriasis lesions,and the frequency reduced in static stage psoriatic lesions and normal skin(P<0.01). Conclusions There may be a close relationship between the development of psoriatic lesion and apoptosis of KC. Fas/FasL might be involved in the pathogenesis of psoriasis.

　　【Key Words】 psoriasis keratinocyte apoptosis Fas FasL

　　近年来银屑病发病与细胞凋亡的关系逐渐受到重视，Fas/FasL是现今研究较多、较为重要的细胞凋亡相关基因。作者应用免疫组化和TUNEL法对银屑病患者皮损中Fas、FasL的表达和皮损中角质形成细胞凋亡进行了检测。结果报告如下

　　1 对象和方法

　　1.1 研究对象 寻常型银屑病26例，其中男14例，女12例，年龄15～65岁(平均28.5岁);进行期13例，静止期13例;病程6个月～16年(平均8.3年)。正常对照组10例来自整形外科正常皮肤，其中男6例，女4例，年龄18～51岁(平均25.8岁)。两组患者年龄、性别无统计学差异,具有可比性。

　　1.2 试剂 细胞凋亡检测试剂盒、Fas、FasL兔抗人多克隆抗体(工作浓度均为1：150)购于北京中山生物技术有限公司，用试剂盒附带的肺癌石蜡切片为阳性对照，PBS液代替一抗作阴性对照。

　　1.3 方法 (1)免疫组化：石蜡切片(约4μm)常规处理后，微波炉抗原修复，依次加入稀释的一抗、生物素标记二抗、SABC，DAB显色、苏木素复染。结果按着色强弱分级：无着色为0，浅黄色为1，深黄色为2，棕黄色为3。着色范围以在×40倍镜下随机选取5个视野(每个视野计数100个细胞)计数阳性细胞所占的百分比均值，<25%为1，25%～50%为2，>50%为3。上述两项相加即为Fas、FasL表达强度积分，<2为阴性，≥2<3为弱阳性(+)，3～4为阳性(++)，>4为强阳性(+++)。(2)TUNEI染色：切片脱蜡入水,蛋白酶K消化15min,置体积分数0.03的H2O室温处理20min,标记缓冲液湿盒中37℃孵育60min,1:50稀释的亲和素-辣根过氧化物酶37℃孵育30min,DAB显色液显色10min,苏木素复染,镜检，细胞核中有棕黄色颗粒者即为凋亡阳性细胞，在每张阳性片随机取5个阳性细胞最多的高倍视野(×400)计算凋亡指数(AI)。

　　1.4 统计学分析 采用SPSS 12.0软件包处理，样本表达强度比较用秩和检验，细胞凋亡比较用方差分析。

　　2 结果

　　2.1 Fas、FasL表达强度 阳性信号为胞浆内出现黄色颗粒，以PBS代替一抗的阴性对照切片中，无任何阳性反应。Fas、FasL在正常表皮基本不表达;银屑病皮损中既表达Fas又表达FasL，二者分布基本一致，但Fas表达强于FasL。进行期皮损Fas、FasL表达低于静止期皮损(P<0.05)。详见表1。

　　表1 Fas、FasL在正常人与患者皮损中表达比较(略)

　　2.2 KC凋亡情况(TUNEL片，×400) 所有病人皮损组织中均有凋亡的阳性细胞，而正常皮肤偶见凋亡阳性细胞。皮损中角质形成细胞凋亡的比例明显高于正常对照组(P<0.01)，且病程的不同阶段角质形成细胞AI不同，进行期高于静止期。详见表2。

　　表2 TUNEI染色结果比较(略)

　　注：与正常组比较，P<0.01;与静止期比较，△P<0.05

　　3 讨论

　　KC是表皮的主要组成细胞，具有较强的生长、增殖和分化能力，是皮肤更新、屏障和免疫的主要功能性细胞之一。其凋亡是在一定生理或病理条件下,遵循其自身程序结束生命的一个主动的、高度有序的、基因控制的、一系列酶参与的过程,许多皮肤疾病的发生和发展与KC的凋亡密切相关。Fas(CD95)是一种膜受体，Fas单克隆抗体在体内外与Fas结合后均能导致表达Fas的细胞发生凋亡，从而证明Fas是一种识别Fas配体(FasL)，并将凋亡信息传递给细胞的细胞表面受体，故Fas基因又称“凋亡基因”。Takahashi等[1]用RT-PCR技术分析银屑病皮损区Fas发现，其表达量较正常表皮增高，认为银屑病皮损形成可能是因皮肤凋亡相关分子表达异常所致。在恶性黑色素瘤中FasL呈强表达，Fas表达较弱，逃避了T细胞监视而增殖和转移[2]。推测银屑病皮损大多维持良性增生性质，因为KC既表达Fas又可表达FasL，且Fas表达强于FasL，可能通过某种“自杀”或T细胞监视，从而没有恶变。

　　本研究从局部Fas系统介导的细胞凋亡角度探讨银屑病发病的机制，结果表明：Fas、FasL在银屑病患者皮损中表达均升高，二者分布基本一致，但Fas表达强于FasL，健康对照组基本不表达。KC凋亡检测发现，患者皮损组织中均有凋亡的阳性细胞，而正常皮肤偶见凋亡的阳性细胞，与文献一致[3]。由此推测：银屑病皮损组织中Fas、FasL的强表达是导致患者表皮KC异常凋亡的机制之一，但由于Fas表达强于FasL，使KC不能平衡地表达Fas、FasL以及时清除病变的KC，从而维持银屑病皮损良性增生的性质。Fas、FasL表达与增殖性皮肤病良恶性关系及调节机制有待进一步探讨。

　　【参考文献】

　　1 Takahashi H,Manabe A,Ishida-Yamamoto A,et al. Aberrant expression of apoptosis related molecules in psoriatic epidermis. Drmatol Sci,2002,28(3):187～197.

　　2 Hahne M, Rimoldi D，Schroter M，et al.Melanom cell expression of Fas (APO-1/CD95)ligand:Implications for tumor immue escape. Science,1996,274:1363～1366.

　　3 Ruckert R,Asadullah K,Seifert M,et al.Inhibition of keratinocyte of psoriasis.J Immunol,2000,165:2240.