MMP-9、TIMP-1在皮肤恶性黑色素瘤的表达及意义

　　作者：姜辉 作者单位：深圳市妇幼保健院，广东 深圳 518028

　　【摘要】目的：探讨基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及其组织抑制物-1(TIMP-1)在皮肤黑色素瘤中的表达及临床病理学意义。方法：采用免疫组织化学S-P方法观察MMP-9和TIMP-1在51例皮肤黑色素瘤及15例色素痣石蜡切片中的表达，使用图像分析技术对免疫组化结果进行定量分析。结果：与色素痣比较，皮肤黑色素瘤中MMP-9表达较强(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1比值较高(P<0.05)。MMP-9和TIMP-1的表达及MMP-9/TIMP-1比值与黑色素瘤浸润深度有关(P<0.05)。有淋巴结转移者MMP-9表达较强(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1比值较高(P<0.05)。结论：MMP-9、TIMP-1蛋白的表达与皮肤黑色素瘤的侵袭性有关，MMP-9/TIMP-1比值增高提示肿瘤具有较高侵袭转移能力。

　　【关键词】 黑色素瘤;明胶酶B;金属蛋白酶类组织抑制剂

　　Expression and Significance of Matrix Metalloproteinase-9 and its Tissue Inhibitor in Cutanious Melanoma

　　JIANG Hui

　　(Shenzhen Maternity and Child Health Hospital,Guangdong 518028,China)

　　Abstract:Objective To investigate the expression of matrix metalloproteinase-9(MMP-9) and its tissue inhibitor (TIMP-1) in cutaneous melanoma and 15 cases of nevus,immunohistochemical.Methods In 51 cases of cutanious melanoma and 15 cases of nevus, immunohistochemical method of streptavidin-peroxidase was used to observe the expression of MMP-9 and TIMP-2 proteins on the paraffin embeddd sections. The immunohistochemicas result were analyzed quantitatively using an image analysis system.Results The expression of MMP-9 was stronger and the ratio of MMP-9/TIMP-1 was higher in cutaneous melanoma than that in nevus (P<0.05).The expression of MMP-9 and TIMP-1 and the ratio of

　　浸润和转移是衡量肿瘤生物学行为的最重要指标。细胞外基质和基底膜是肿瘤生长、播散的屏障。肿瘤从原位增值到浸润转移的演变过程中，必须降解细胞外基质和基底膜，基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)及其内源性抑制剂(Tissue Inhibitors of Metalloproteinases,TIMPs)在此起重要作用[1～3]，其中MMP-9能特异性降解Ⅳ型胶原而促进肿瘤的浸润转移，而TIMPs)特异性地与MMP-9结合，抑制其活性。黑色素瘤是一种进展快，侵袭性强，易发生转移的恶性肿瘤。本文观察MMP-9、TIMP-1皮肤黑色素瘤的表达情况，并探讨其意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 病例资料

　　收集皮肤恶性黑色素瘤51例，患者年龄30岁～93岁，平均57.8岁;男20例，女31例。皮损位于足步者22例，头面部11例，上肢和手部9例，躯干8例，外阴1例。其中21例有随访资料。以我院皮肤科和外科切取的皮肤色素痣病变标本15例为对照。

　　1.2 实验方法

　　试剂：即用型鼠抗人单克隆抗体MMP-9(GE-213)、鼠抗人单克隆抗体TIMP-1(102D1)和S-P试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。方法：免疫组织化学染色采用S-P法操作，石蜡包埋组织4 μm连续切片连续切片，常规脱蜡、水化;TIMP-1标即织切片使用0.01M柠檬酸缓冲液高压抗原修复，MMP-9标记切片未做抗原修复;滴加第一抗体，室温下孵育60 min;滴加第二抗体，室温下赋予10 min;以上各步骤间均使用PBS漂洗3次。DAB显色，苏木素对比染色，中性树胶封片。以已知阳性的胃癌组织切片为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.3 结果评价

　　MMP-9、TIMP-1阳性标记均显示为胞质型棕黄色颗粒，个别病例也显示部分核着色。使用CMIAS-008多功能病理图像分析系统(北京航天航空工业大学产品)，在Olympus VANOX显微镜下分别测量每张切片中肿瘤细胞阳性成分的平均吸光度(A值)，代表其免疫标记强度。每例标本切片随机选取5个瘤巢，于周边和中央各取1个10×20倍视野，共10个视野采集图像，在监视器显示下对目标进行必要的修饰编辑，计算机对目标进行自动测量。

　　1.4 统计学处理

　　测量所得数据使用PSMS3.1医学统计学软件包进行处理，计量资料进行t或t’检验，以P<0.05为差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 病理组织学观察

　　51例皮肤恶性黑色素瘤中，表浅扩散型13例，肢端雀斑样型7例，结节型31例。结合文献根据肿瘤浸润深度进行分级;Ⅰ级3例，肿瘤局限于表皮或附属器上皮内;Ⅱ级1例，肿瘤局部侵及真皮乳头;Ⅲ级7例，肿瘤充满真皮乳头，未侵及网状层;Ⅳ级11例，肿瘤侵及网状层;Ⅴ级29例，肿瘤侵及皮下组织。病理组织学检查证实有引流淋巴结转移者19例。记录有骨转移4例，肺转移4例，脑转移2例。15例色素痣中，皮内型10例，复合型4例，交界型1例。

　　2.2 MMP-9、TIMP-1的表达

　　15例皮肤色素痣中，均见痣细胞呈MMP-9、TIMP-1阳性表达。9例MMP-9在表皮呈阳性表达，10例表皮细胞TIMP-1阳性，阳性表达的表皮细胞主要见于颗粒层和棘细胞层。真皮层中纤维细胞、淋巴细胞、浆细胞、单核细胞、血管内皮细胞也呈阳性表达。51例皮肤恶性黑色素瘤中，MMP-9、TIMP-1呈弥漫阳性表达;间质中纤维细胞、淋巴细胞、浆细胞、单核细胞、分叶核粒细胞、血管内皮细胞也呈阳性表达。

　　2.3 MMP-9、 TIMP-1表达的图像分析

　　MMP-9、TIMP-1蛋白在皮肤黑色素瘤核色素痣中的表达情况(见表1)。MMP-9、TIMP-1蛋白的表达与黑色素瘤病变大小、浸润深度、转移情况、生存情况等临床病理指标的关系(见表2)。表1 MMP-9、TIMP-1蛋白在皮肤黑色素瘤和色素痣中的表达(略)表2 MMP-9、TIMP-1蛋白的表达与黑色素瘤各临床病理指标的关系(略)注：*有记录者35例，**有随访资料者21例。

　　3 讨论

　　深入认识恶性肿瘤侵袭转移的发生机制和规律，是肿瘤学、病理学的重要课题。肿瘤对周围细胞外基质、基底膜的破坏是发生浸润播散的重要环节。细胞外基质是由蛋白、蛋白多糖、弹性蛋白和胶原蛋白等组成的结缔组织三维网状结构，不断代谢更新和降解重塑的动态平衡中，这种动态平衡的失调与肿瘤的浸润、转移关系密切。肿瘤细胞通过表面受体与细胞外基质成分黏附，分泌多种蛋白水解酶，使贴近肿瘤表面的有限区域的基质降解，形成转移通路。在细胞外基质合成与降解的代谢平衡调节中，MMPs和TIMPs是两个重要的酶系统。

　　MMPs成员据报道有20余种[4],是一组锌离子依赖性内肽酶，几乎能降解细胞外基质的所有成分。Ⅳ型胶原是细胞外基质的主要成分之一，由于具有独特的α螺旋结构，大部分蛋白酶对Ⅳ型胶原无降解作用，而MMPs中的Ⅳ型胶原酶则可作用于Ⅳ型胶原的特异位点使其降解。MMP-9作为Ⅳ型胶原酶的一种，能够降解结缔组织及细胞外基质大分子,如Ⅳ/Ⅴ型胶原、蛋白多糖、层粘蛋白、纤维连接蛋白等，在肿瘤浸润转移过程中发挥重要作用。H-ras和Adv-EIA基因转染的大鼠胚胎细胞原本无转移性，但在转染MMP-9表达载体后，转变为有转移能力的胚胎细胞，说明MMP-9与细胞的侵袭性密切相关[5]。肿瘤细胞在异常分化的同时，还诱导周围的间质细胞表达MMP-9，破坏细胞外基质的正常微环境，以促进肿瘤的浸润转移[6]。黑色素瘤是侵袭性很强的肿瘤，在多个培养的黑色素瘤细胞系中，都显示高水平的MMPs[2]。在黑色素瘤浸润方向的正面，可以观察到弹性蛋白碎裂[3]。我们使用免疫组织化学标记也证明，皮肤黑色素瘤具有较强的MMP-9表达，与皮肤色素痣比较，差异有显著性。

　　TIMPs是MMPs的特异性抑制剂，在体内分布广泛，其中TIMP-1是糖蛋白，可与活化的间质胶原酶、间质溶解素和MMP-9形成复合物，在调控MMPs活性方面起重要作用。TIMPs在肿瘤细胞生长、扩散中起的主要作用是调节MMPs的水解活性。有研究显示，在恶性肿瘤组织中，TIMP-1 RNA和TIMP-1表达并未减少，反而较正常组织增高，本研究所得结果也同样显示恶性黑色素瘤组织中TIMP-1表达水平并未降低，而是略高于对照的色素痣，只是差异无显著性。尽管TIMP-1在黑色素瘤中表达也升高，但由于MMP-9在肿瘤中的高表达，MMP-9/TIMP-1比值仍然显著高于色素痣，显示MMP-9/TIMP-1调节失衡，破坏细胞外基质作用增强，与文献报道在皮肤上皮性肿瘤中所见一致[7]。这种情况支持观察MMP-9/TIMP-1比值比单纯观察MMPs或TIMPs水平更能反映肿瘤侵袭性的意见。当然，MMP-9与Ⅳ型胶原也并非简单的酶-底物、降解-被降解的关系，它们之间的复杂作用机制有待进一步研究，同时也不排除TIMP-1在肿瘤细胞代谢中可能还有其他作用。

　　我们观察到，MMP-9和TIMP-1的表达与皮肤黑色素瘤的浸润深度、淋巴结转移情况有关，肿瘤浸润深(Ⅳ级～Ⅴ级)者及有淋巴结转移者显示MMP-9表达强度、MMP-9/TIMP-1比值明显高于肿瘤浸润较浅(Ⅰ级～Ⅲ级)、无淋巴结转移者，但与就诊时肿瘤大小、有无其他部位或内脏器官转移无明显关系。生存期≤1 a者MMP-9、TIMP-1表达强度及MMP-9/TIMP-1比值与生存1 a以上者比较有差异，但由于获得随访的例数较少，未显示统计学意义。

　　【参考文献】

　　[1]O-Charonrat P, Rhys- Evans PH. Eccles SA.Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors correlates with invasion and metastasis in squam ous cell carcinoma of the head and neck[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2001,127:813-820.

　　[2]Huntington JT, Shields JM,Der CJ,et al.Overexpression of collagenase 1 (MMP-1) is mediated by the ERK pathway in invasive melanoma cells: role of BRAF mutation and fibroblast growth factor signaling[J].J Biol Chem,2004,279:33168-33176.

　　[3]Natayi C, Labuousse AL, Debret T,et al.Elastin-derived peptides up regulate matrix metalloproteinase-2- mediated melanoma cell invasion through elastin-binding protein[J].J Invest Dermatl,2004,122: 256-265.

　　[4] Nelson AR, Finglston B, Rothenberg ML, et al.Matrix metalloproteinase:biologic activity and clinical implications [J]. J Clin Oncol,2000,18:1135-1149.

　　[5]张金库.基质金属蛋白酶及其抑制剂与肿瘤关系的研究进展[J].诊断病理学杂志,2004,11:269-271.

　　[6] Airola K, Fusenig NE. Differential stromal regulation of MMP-1 expression in benign and malignant keratinocytes[J].J Invest Dermatol,2001,116:85-92.

　　[7]马泽粦, 樊翌明, 吴志华, 等. 皮肤鳞状细胞癌和基底细胞上皮瘤膜型基质金属蛋白酶-1、 基质金属蛋白酶-2 表达 [J]. 中华皮肤科杂志,2004,37:584-586.