初发系统性红斑狼疮患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞和TGF-β1含量

　　作者：谭国珍， 罗益金， 曾凡钦 作者单位：(中山大学附属第二医院皮肤科， 广东 广州510120)

　　【摘要】 【目的】 了解初发系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞和TGF-β1在SLE发病中的作用。 【方法】 流式细胞仪检测25例初发未治疗的SLE患者和15例健康对照者外周血单个核细胞中CD4+CD25+、CD4+CD25+ Foxp3+调节性T细胞占CD4+ T 细胞的百分比，ELISA检测血清中TGF-β1含量。【结果】 SLE患者PBMC中CD4+CD25+ T细胞、CD4+CD25+Foxp3+ T细胞占CD4+ T细胞百分比均较健康对照组明显减少(分别为7.9 ± 2.2 vs 12.5 ± 5.3和2.1 ± 1.1 vs 4.0 ± 1.8，P < 0.05)。SLE患者血清中TGF-β1含量(pg/mL)低于健康对照组(214 ± 48 vs 419 ± 85，P < 0.05)。SLE患者PBMC中CD4+CD25+ T细胞、CD4+CD25+Foxp3+ T细胞占CD4+ T细胞的百分比以及血清TGF-β1的含量均与病情活动指数(DAI)成负相关(r分别 = -0.68、-0.56、-0.53， P < 0.05)，但各型T细胞占CD4+ T细胞的百分比与血清TGF-β1的含量之间相关分析均无统计学意义。 【结论】 Treg与TGF-β1参与SLE的发病，两者均可作为病情活动的观察指标。且血清TGF-β1的含量与Treg占CD4+ T细胞的百分比在SLE中的下降趋势一致，提示两者之间存在一定的联系，推测是TGF-β1的不足导致Treg的生成减少。

　　【关键词】 调节性T细胞; TGF-β1; 系统性红斑狼疮

　　系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus， SLE)是一种较常见的全身多器官系统受累的自身免疫病，病因及发病机制未明，目前认为其根本原因是机体对自身抗原失去免疫耐受，自身反应性免疫细胞失去调控所致[1-2]。调节性T细胞(regulatory T cells， Treg)和转化生长因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)在稳定机体的免疫平衡、维持机体免疫耐受中起着至关重要的作用。两者无论在数量上还是在功能上的缺陷均可导致自身免疫病的发生[3-4]。系统性红斑狼疮作为一种典型的自身免疫病，Treg和TGF-β在疾病发生发展中的作用已引起了学者们的关注[3，5]。然而，迄今为止，对Treg和TGF-β1在SLE发病中的作用认识不足，两者在SLE中的相互关系缺乏研究。本研究拟观察初发SLE患者体内外周血单个核细胞(PBMC)中CD4+CD25+ T细胞、CD4+CD25+ Foxp3+ T细胞占CD4+ T细胞的百分比及血清中TGF-β1水平，并进一步分析它们之间的相互关系及与病情活动的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　25例SLE患者均为2005年6月-2008年2月期间中山大学附属第二医院皮肤科门诊或住院患者，均符合1997年ARA SLE诊断标准，均为初次确诊未使用任何药物治疗者，均处于病情活动期(DAI≥10分)，外周血采集经患者本人同意。全部为女性;年龄13 ～ 42岁，平均年龄27.0岁;病程2月 ～ 1年，平均5月;DAI评分为13 ～ 26，平均评分为21.2。15例健康志愿者均来自我院健康体检中心，性别、年龄与患者组相匹配，均为女性，年龄12 ～ 42岁，平均年龄26.2岁，无系统性疾病及免疫性疾病病史及家族史。外周血采集经志愿者同意。

　　1.2 主要试剂

　　相对密度1.077 ± 0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(天津TBD)，抗人CD4-FITC、抗人CD25-PE、抗人Foxp3-APC(美国eBioscience)，人类TGF-β1 ELISA Set(美国BD公司)。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 T细胞的检测 清晨采集空腹SLE患者、健康对照组外周血每人8 mL，用肝素钠抗凝。采用人Ficoll-Hypaque淋巴细胞分层液的密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。采用双色或三色荧光抗体标记流式细胞仪检测法检测新鲜外周血单个核细胞中调节性T细胞相关表型，计算出CD4+CD25+ T细胞、CD4+CD25+ Foxp3+ T 细胞占CD4+ T 细胞的百分比。具体操作均由中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心流式细胞仪室完成。

　　1.3.2 血清中TGF-β1含量的检测 收集病例组及对照组血清每人300 μL，-20 ℃冰箱保存备用。严格按照ELISA试剂盒中的操作步骤，绘制出标准曲线，根据样品光密度值在标准曲线图上查出相应TGF-β1含量。

　　1.4 统计学方法

　　采用SPSS 13.0统计软件包分析实验数据。各组间的差异比较采用单因素方差分析;两变量间的相关性分析采用Pearson回归相关分析法。显著性水准α设为0.05。

　　2 结 果

　　2.1 SLE患者PBMC中各型T细胞占CD4+ T细胞的百分比

　　初发SLE患者PBMC中CD4+CD25+ T细胞、CD4+CD25+Foxp3+ T细胞占CD4+ T细胞百分比均较健康对照组明显减少，分别为7.9 ± 2.2 vs 12.5 ± 5.3(F = 15.08，P = 0.00)和2.1 ± 1.1 vs 4.0 ± 1.8(F = 18.924，P = 0.00)，差异有统计学意义(P < 0.05)。

　　2.2 SLE患者血清中TGF-β1的含量

　　初发SLE患者血清中TGF-β1含量(pg/mL)低于健康对照组(214 ± 48 vs 419 ± 85，F = 95.680，P = 0.00)，差异有统计学意义(P < 0.05)。

　　2.3 各型T细胞百分比及血清TGF-β1的含量与病情活动之间的相关分析

　　初发SLE患者PBMC中CD4+CD25+ T细胞、CD4+CD25+Foxp3+ T细胞占CD4+ T细胞的百分比以及血清TGF-β1的含量三者均与病情活动指数(DAI)成负相关(P < 0.05)，相关系数分别为r = -0.68、-0.56、-0.53，但两种百分比与血清TGF-β1的含量之间相关分析均无统计学意义。

　　3 讨 论

　　Treg具有调控自身反应性T细胞的生成、活化、增殖的作用，在稳定机体免疫平衡、维持外周免疫耐受中起重要作用。动物实验表明Treg的异常是导致自身免疫病的直接原因。SLE是一种典型的自身免疫性疾病，其抑制性T细胞(Treg)存在缺陷。有报道SLE患者体内Treg减少，并认为Treg的减少与SLE的发病有关[6]，但是这些研究在病例的选择上未能注意排除治疗药物如糖皮质激素等对Treg的影响，而事实上已有研究报道糖皮质激素可以上调Treg的百分比[7]。因此，我们选择了25例初发未使用过任何药物的活动期SLE患者为研究对象，更能客观地反映出SLE患者体内Treg的真实情况。我们同时检测CD4+CD25+ T细胞、CD4+CD25+Foxp3+ T 细胞，能更全面地了解Treg不同功能群的状况。结果发现，初发未治疗的活动期SLE患者PBMC中无论是CD4+CD25+ T细胞还是CD4+CD25+Foxp3+ T细胞占CD4+ T细胞的百分比均比健康对照组低，差异具有统计学意义。已知CD25分子高表达在Treg细胞上，同时也可表达在活化的T细胞表面，据以往的研究结果显示在活动期的SLE患者体内存在有T细胞的异常活化，因此，CD4+CD25+ T细胞亚群并不能完全真实地反映患者体内的Treg水平，患者体内的Treg的实际水平应较检测结果更低。Foxp3是目前公认的Treg的特异性标志，检测CD4+CD25+Foxp3+ T细胞较能反映真实的Treg水平，结果表明SLE患者体内确实存在Treg的缺陷。此外，研究结果还发现SLE患者PBMC中CD4+CD25+ T细胞、CD4+CD25+Foxp3+ T 细胞百分比均与疾病活动指数成负相关。因此，我们推测SLE患者体内Treg比例减少，导致其对自身反应性淋巴细胞的抑制能力减弱，从而与SLE致病有关，且其数量与病情活动指数成负相关，可以作为临床病情观察的新指标。最近，国内外相继有学者对SLE患者体内Treg进行了研究，Lee等发现儿童活动期SLE患者CD4+CD25+ T细胞比健康对照组和稳定期患者明显减少，并且与疾病的活动程度和抗ds-DNA滴度呈负相关[8]，结果与我们的一致。

　　在SLE患者体内存在细胞因子的异常，TGF-β1作为一种免疫抑制因子在SLE发病中的作用已有少量的研究报道，发现SLE患者外周血中TGF-β1水平较正常人低，并且与疾病的活动度成负相关[9]。但这些研究在病例的选择上未排除激素等药物对TGF-β的影响，事实上已知环孢素A、维甲酸等药物可以影响TGF-β的产生。为此，本研究选择了15例从未使用过任何药物的初发SLE患者为研究对象，结果发现初发患者血清TGF-β1的水平明显低于健康对照组，差异有统计学意义，且与病情活动指数成负相关，结果与Hammad等[9]报道的一致。说明TGF-β1的异常与SLE发病有关，TGF-β1的含量可作为病情观察指标。推测TGF-β1的减少导致其免疫抑制作用减弱，使自身反应性T、B细胞过度增殖，产生大量自身抗体，导致疾病的发生发展。

　　SLE患者Treg减少的原因尚不清楚。TGF-β1是一种与Treg关系非常密切的细胞因子，无论在Treg功能的发挥上还是在外周Treg数量的维持上均起着十分重要的作用[10-11]。

　　我们的研究发现初发的SLE患者中Treg与TGF-β1的变化趋势一致，均比健康对照低，虽未发现两者成明显的正相关，但根据以往的研究结果我们仍有理由推测两者之间存在一定的联系，是TGF-β1减少导致Treg的生成减少抑或是Treg减少导致TGF-β1的产生减少?既往有学者认为是Treg减少导致TGF-β1的生成减少，从而使Treg的功能发挥受到影响[12]。但我们认为前者的可能性更大，因为体内TGF-β1的来源广泛，可由各种淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞等合成和分泌，而Treg在体内的比例很少，在正常人体内Treg仅占总淋巴细胞的5%以下，SLE患者更低，Treg的减少并不足以引起TGF-β1的量减少。而TGF-β1则是体内诱导Treg产生的主要途径，以往研究证明TGF-β1可诱导初始CD4+ T细胞转化为Treg，诱导CD4+CD25- T 细胞转化为CD4+CD25+Foxp3+ T细胞，因此推测TGF-β1的不足导致Treg的生成减少的可能性更大。它们之间的而确切因果关系尚有待进一步研究。

　　总之，我们的研究发现SLE患者体内PBMC中Treg比例减少，血清TGF-β1含量降低，且均与病情活动成负相关，提示Treg与TGF-β1参与SLE的发病，两者均可作为病情活动的观察指标。且血清TGF-β1的含量与Treg的比例在SLE中的下降趋势一致，提示两者之间存在一定的联系，推测是TGF-β1的不足导致Treg的生成减少。

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