分子在尖锐湿疣皮损中的表达

　　作者：潘永正,骆丹 　(南京医科大学第一附属医院 皮肤科,江苏 南京 210029)

　　[摘要]目的：研究CD1a和Ecadherin分子在尖锐湿疣(CA)皮损中的表达情况及相互关系，探讨CA皮损局部免疫微环境的变化。方法：采用免疫组化法检测38例CA患者皮损和12名正常人包皮中CD1a和Ecadherin分子的表达。结果：CA皮损中CD1a和Ecadherin分子表达水平较正常包皮显著降低，CD1a和Ecadherin分子的表达呈正相关。 结论：CA患者皮损CD1a和E-cadherin分子表达降低可能导致人乳头瘤病毒(HPV)抗原递呈障碍，在HPV逃逸机体免疫监视的过程中可能发挥重要作用。

　　[关键词] 尖锐湿疣;朗格汉斯细胞;CD1a分子;E钙黏蛋白

　　尖锐湿疣(condyloma acuminatum,CA) 是由人乳头瘤病毒( human papillomavirus,HPV) 感染引起的一种常见的性传播疾病，对CA发病机制的探讨成为目前研究的热点。有人认为HPV持续感染与机体局部免疫监视功能障碍有关。我们通过免疫组化技术对38例CA患者皮损中朗格汉斯细胞(Langerhans cell ,LC)的表面标志CD1a分子和介导角质形成细胞(keratinocyte,KC)与LC粘附的E钙黏蛋白(Ecadherin)分子进行检测，以探讨CA皮损局部免疫微环境的改变与HPV免疫逃逸的关系。

　　1 材料和方法

　　1. 1 材料

　　1.1.1 临床标本 38例CA皮损标本取自2005年8月~2006年12月南京医科大学第一附属医院和东南大学附属中大医院皮肤科性病门诊就诊患者，并经组织病理检查证实，符合2000年卫生部防疫司制订的CA诊断标准。其中男29例,女9例,平均年龄32岁(21~45岁)，病程2周～9个月，初发未经治疗者30例，复发8例。12例正常对照来自泌尿外科包皮环切术的正常皮肤，对照者平均年龄30岁(18~50岁)。

　　1.1.2 主要试剂 鼠抗人CD1a单克隆抗体，鼠抗人Ecadherin单克隆抗体，即用型UltraSensitiveTMSP免疫组化试剂盒，DAB酶底物显色剂(均购自福州迈新生物技术公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫组化染色 取CA患者局部皮损和正常包皮组织,10%甲醛固定，石蜡包埋。每份CA标本均取1张作常规苏木素伊红染色确诊，所有标本各取2张分别用CD1a抗体和Ecadherin抗体进行免疫组化染色，用PBS代替一抗作阴性对照。操作步骤为:常规脱蜡、水化、抗原修复，依次滴加过氧化物酶阻断剂、封闭血清、一抗、生物素标记的二抗、链霉素抗生物素过氧化物酶溶液，DAB显色。

　　1.2.2 染色结果判断标准 CD1a的表达：将染色后的切片置于光镜下观察,细胞膜或细胞浆呈黄褐色的树枝状突起的细胞为CD1a阳性的LC,每张切片任意取LC分布最密集的5个区,在光镜高倍视野下计数CD1a阳性细胞的数目。以5个高倍视野下CD1a 阳性细胞平均数为LC数目[1]。Ecadherin的表达：光镜下观察，胞膜或胞浆内有连续线状或斑点状黄色至棕黄色颗粒沉积者为阳性染色细胞。Ecadherin的表达强度标准参照[2]基于染色强度和分布范围的半定量记分方法：即染色强度(A)[3棕褐色;2棕黄色;1淡黄色]，分布范围(B)[3，超过66%的表皮细胞着色;2，33%~66%的表皮细胞着色;1，小于33%的表皮细胞着色]和两者记分的乘积(A×B)。光镜下随机观察5个高倍视野,结合染色强度和分布,予以半定量评分，取均值。

　　1.3 统计学方法CD1a和Ecadherin在CA和正常包皮组织中表达的差异采用独立样本t检验，CD1a和Ecadherin分子之间的表达关系采用线性相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 CA皮损和正常皮肤中CD1a和Ecadherin的检测结果正常包皮组织表皮中可见较多CD1a+的细胞镶嵌于基底层和棘层细胞间,表皮中部较多。胞体形状不规则，部分呈圆形、椭圆形，每个细胞周围见3～4 个细长突起，部分可见二级突起(图1)。12例正常包皮标本中CD1a+的细胞数目为(21.59±10.48)个。CA皮损表皮中CD1a+的细胞数量较少,分布以表皮中、下部相对多见。胞体较小,突起明显减少、缩短，甚至消失,极少见到二级突起,典型的树突状细胞少见,甚至仅表现为点状或条状的胞突结构(图2)。个别标本的表皮局部CD1a+的细胞消失。38例CA标本LC数目为(10.66±11.71)个,与正常对照相比明显降低, P< 0.01(表1)。图1 正常包皮CD1a的表达 SP×400正常包皮组织表皮Ecadherin在基底层、棘层、颗粒层下部强阳性染色,细胞膜可见棕黄色连续性线状着色，胞浆内见棕黄色颗粒沉积(图3)，其表达评分值为7.67±1.64。CA 皮损表皮中Ecadherin与正常表皮相比染色明显变淡，部分皮损内无明显着色，胞浆内棕黄色颗粒较少见(图4)，其表达评分值为2.36±1.41，与正常对照相比表达明显降低,P<0.01(表1)。表1 CA皮损和正常包皮中CD1a和 Ecadherin的表达(略)

　　2.2 CA皮损和正常包皮中CD1a和Ecadherin表达的相关性在Ecadherin低表达的CA组织中CD1a+细胞数目较少，在Ecadherin高表达的正常皮肤组织中CD1a+细胞数目较多。在正常皮肤和CA皮损表皮内，Ecadherin表达的强度和CD1a+细胞数目之间存在正相关关系( r=0.627 6,P=0.01)。

　　3 讨 论

　　CA是HPV感染引起的皮肤黏膜新生物型的性传播疾病,而持续性高危型病毒(HPV16,18等)感染与宫颈癌的发生密切相关[3]。由于HPV感染主要局限于皮肤黏膜的表皮，极少或不进入血液，局部皮肤黏膜的免疫尤其是细胞免疫，在清除HPV持续性感染方面具有极其重要的作用。表皮内的LC是皮肤中未成熟的树突状细胞(dendritic cell,DC)，是专业的抗原递呈细胞，能表达一系列分化抗原,其中最直接与其功能有关的是CD1a、MHCⅠ 类分子、HLADR、CD80、CD83、CD86、CD40等。CD1a是一种递呈脂类抗原的分子,目前被公认为DC的主要特征性标志,已广泛应用于DC分离、纯化和体外培养的鉴定[4]。目前对HPV感染后表皮内LC数目和功能变化的研究主要集中在宫颈上皮内瘤样病变和宫颈癌方面[5]。本研究应用CD1a单克隆抗体对正常皮肤和CA皮损进行免疫组化染色后发现,CA皮损中表皮内CD1a+细胞即LC较正常皮肤明显减少，树突缩短、减少甚至消失。HPV感染后表皮内LC数量显著减少、密度显著降低，可能导致LC向辅助性T淋巴细胞递呈HPV抗原的能力下降，限制特异性免疫应答的启动，从而引起HPV的持续性感染，造成CA皮损的持续存在或治疗后容易复发。Ecadherin是一种钙离子依赖的细胞间粘附分子,具有细胞粘附和维持细胞形态功能的作用，是肿瘤浸润转移的抑制因子,一旦失去Ecadherin,细胞便变得松散并倾向于浸润[6]。表皮内的Ecadherin分子表达于基底层及基底层上的KC和不成熟的LC表面,介导KC之间以及KC与LC之间的粘附,对LC在表皮基底层的定位及滞留都很重要[7]。宫颈鳞癌和鳞状上皮内病变组织中CD1a+的LC密度降低和Ecadherin的表达下降，进一步体外研究发现DC、LC与Ecadherin-、HPV转化的KC无明显粘附作用，但在转染Ecadherin cDNA后粘附作用明显加强，Ecadherin介导的KC与LC之间的粘附对HPV慢性感染时特异性免疫反应的激活和维持具有重要意义[2]。本研究证实,在CA表皮中Ecadherin的表达明显下降，同时伴有表皮内LC的密度降低，两者有正相关关系。因此，CA表皮内LC的减少可能与局部Ecadherin的表达下降，导致LC在表皮内难以滞留有关[7]。

　　[参考文献]

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　　[7]MATTHEWS K,LEONG C M,BAXTER L,et al. Depletion of langerhans cells in human papillomavirus type 16infected skin is associated with E6mediated down regulation of Ecadherin[J]. J Virol,2003,77:83788385.