靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定

　　作者：王慧， 魏志平*，刘彦群 作者单位：(徐州医学院附属医院皮肤科，江苏徐州221002)

　　【摘要】 目的 构建靶向表皮生长因子受体(EGFR)的短发卡状RNA(shRNA)质粒表达载体并进行鉴定。方法 ①根据人类EGFR的mRNA序列，设计4条干扰片段，以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体，构建shRNA重组体，转化入DH5a大肠杆菌，提取质粒，进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin 2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞，用G418筛选阳性克隆。结果 ①经酶切及测序鉴定，成功构建了针对 EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞，经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论 利用 RNAi技术原理成功构建针对 EGFR的shRNA重组质粒，并转染入Colo-16细胞。

　　【关键词】 表皮生长因子受体;RNA干扰;短发卡状RNA;转染

　　Establishment and identification of ShRNA expression vectors

　　of recombinant targeting gene EGFR

　　WANG Hui, WEI Zhiping*, LIU Yanqun

　　(Department of Dermatology, The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract： Objective To establish and identify the plasmid expression vector encoding short hairpin RNA (shRNA) targeting epidermal growth factor receptor (EGFR) of human gene. Methods ①Four short hairpin RNAs (shRNA) were designed according to the homo sapiens EGFR mRNA ID, and then recombinant shRNA was reconstructed, with PGPU6/GFP/Neo plasmids as vectors, respectively. The plasmids were transferred into E. coli DH5α for plasmid extraction and the subsequent identification by enzyme digesting and sequencing. ②Four recombinant plasmids were transfected into Colo-16 cells with lipofectamine 2000 and were screened for positive clones by G418. Results ①The results of enzyme-digestion sequencing confirmed that four plasmids containing shRNA were successfully constructed. ②Four recombinant plasmids were successfully transfected into Colo-16 cells and the cell clones with stable expression were obtained. Conclusion With RNAi technology, the recombinant shRNA plasmids targeting EGFR were successfully established and transfected into Colo-16 cells.

　　Key words: epidermal growth factor receptor; RNA interference; small hairpin RNA; transfection

　　表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)属于表皮生长因子家族[1] (erbB家族)，为原癌基因C-erbB(HER-1)的表达产物，是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，它与表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、转化生长因子(transferring growth factor ,TGF)等配体结合，能激活酪氨酸激酶受体，导致酪氨酸残基的磷酸化，促进细胞无节制地增殖分裂，导致恶性肿瘤的发生[2]。阻断EGFR可抑制肿瘤生长，其作用机制可能与抑制细胞周期进程、加速细胞凋亡、抑制血管生成、抑制浸润和转移、增强化、放疗敏感性等有关[3]。小干扰RNA(siRNA)[4]与同源性mRNA结合, 可靶向切断降解此mRNA, 在蛋白翻译前抑制基因表达[5]。我们构建编码EGFR的短发卡状RNA (shRNA) 质粒表达载体,并对其进行鉴定,为皮肤鳞癌的靶向治疗寻找新的途径。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 空质粒PGPU6/GFP/Neo为Genepharma公司产品。各种限制性内切酶、T4DNA连接酶为美国Promega公司产品。Lipofectamine 2000转染试剂盒为Invitrogen公司产品。感受态菌DH5a购于博大泰克公司;质粒抽提试剂盒购于Promega 公司;G418、卡那霉素购于Sigma公司;人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞由中国医学科学院皮肤病研究所周武庆教授惠赠;RPMI 1640培养基购于GIBCO公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 EGFR siRNA转录模板DNA链的设计、合成 针对EGFR基因的siRNA寡核苷酸序列设计，通过在GenBank上比对[6]，分别选择EGFR基因(NM 005228)CDs编码序列中的第282～300、63～ 81、402～422、506～526特异性序列为siRNA的正义链，按siRNA设计原则，由Ambion公司设计、合成1#、2#、3#、4# EGFR siRNA 4对，经Blast Search检索确认与EGFR以外的人类已知基因序列无同源性。序列如下： 1#siRNA正义链5′-CACAGTGGAGCGAATTCCT-3′，反义链 5′-GTGTCACCTCGCTTAAGGA-3′。2#siRNA正义链5′-GAGTCGGGCTCTGGAGGAA-3′; 反义链 5′-CTCAGCCCGAGACCTCCTT-3′。3#siRNA正义链5′-GCTGCCCATGAGAAATTTACA-3′;反义链 5′-CGACGGGTACTCTTTAAATGT-3′。4#siRNA正义链5′-GCAGTGACTTTCTCAGCAACA-3′; 反义链 5′-CGTCACTGAAAGAGTCGTTGT-3′。根据1#siRNA、2#siRNA 、3#siRNA、4#siRNA序列，设计模板DNA链4条，由Invitrogen公司合成。其构建顺序为BbsⅠ酶切位点、正义序列、9nt loop接头序列、反义序列、 RNA聚合酶Ⅲ终止子(6个T)、BamHⅠ酶切位点。将寡核苷酸序列克隆到载体上。

　　1.2.2 表达质粒PGPU6/GFP/Neo-EGFR shRNA的构建 分别将4对模板链褪火连接,用T4DNA连接酶将其定向插入到 BamHⅠ和BbsⅠ双酶切的PGPU6/GFP/Neo空载体中,构建成重组体质粒。将重组体转化感受态大肠杆菌DH5a,卡那霉素抗性筛选阳性克隆,命名为PGPU6/GFP/Neo-EGFR-282、PGPU6/GFP/Neo-EGFR-63、PGPU6/GFP/Neo-EGFR-402、PGPU6/GFP/Neo。

　　1.2.3 质粒表达载体的鉴定 所得质粒用BamHⅠ, PstⅠ分别酶切鉴定(图2)。阳性重组载体应该可以被BamHⅠ切开，而不能被PstⅠ切开。电泳观察插入子及载体片段的相对分子质量，PGPU6/GFP/Neo-EGFR序列测定由上海Invitrogen公司完成。

　　1.2.4 细胞培养及转染 Colo-16细胞在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中，置5% CO2、37°饱和湿度的恒温培养箱中常规培养。每天记录细胞的生长状态，适时换液、传代。实验所用的细胞均处于对数生长期，且存活细胞百分率均在95%以上。转染时用0.25%胰酶消化后铺6孔板，使其在转染日融合度为80%～90%,用OPTIMEMI无血清培养基250 μl稀释4～5 μg质粒载体和10 μg脂质体Lipofectamine 2000进行转染, 4～6 h后更换完全培养基。24 h后荧光显微镜下观察转染情况。

　　2 结 果

　　2.1 重组质粒鉴定 PGPU6/GFP/Neo-EGFR经酶切后电泳，可观察到在5 000 bp和100 bp左右各有1条带，符合PGPU6/GFP/Neo质粒(5 117 bp)及插入的siRNA片段(55/54/58/58 bp)的特征(见图1)。测序证实与设计的siRNA转录模板序列相同，表明所构建的重组质粒含有设计的目的序列(图2)。

　　图1 重组载体的酶切鉴定

　　M: lamda/Eco130I;最左上侧1-5为EGFR-282 (1-5) PstⅠ酶切结果，其右侧1-5为EGFR-63 (1-5) PstⅠ酶切结果;其右侧1-5为EGFR-282 (1-5) BamHⅠ酶切结果，最右侧1-5为EGFR-63 (1-5) BamHⅠ酶切结果;最左下侧1-5为EGFR-402 (1-5) PstⅠ酶切结果，右侧1-5为EGFR-506 (1-5 PstⅠ酶切结果;右侧1-5为EGFR-402 (1-5) BamHⅠ酶切结果，最右侧1-5为EGFR-506 (1-5) BamHⅠ酶切结果

　　2.2 成功转染和稳定筛选 shRNA表达载体编码shRNA的带绿色荧光蛋白的质粒载体转入Colo-16细胞后在蓝色荧光激发波长下细胞应显示为绿色, 转染后24 h荧光显微镜摄片证实转染成功(图3), G418稳定筛选出阳性克隆。图2 测序结果

　　A.PGPU6/GFP/Neo-EGFR-63;B.PGPU6/GFP/Neo-EGFR-282;C.PGPU6/GFP/Neo-EGFR-402;D.PGPU6/GFP/Neo-EGFR-506

　　图3 转染24 h同视野细胞照片(×400)

　　A.常光照片;B.荧光照片

　　3 讨 论

　　EGFR过表达可以促进肿瘤细胞形成、增殖、黏附、转移和血管形成。在头颈部肿瘤、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、脑胶质细胞瘤等均有 EGFR过表达现象 ,而且在分化低、有转移的病例 EGFR 的阳性率明显增高[7-9]。

　　EGFR是原癌基因 C-erbB1 (HER-1) 的表达产物,人类 EGFR/C-erbB1基因定位于7p12.1～13.2 ,编码的蛋白质为Ⅰ型跨膜酪氨酸蛋白激酶生长因子受体 ,当体内外某些刺激因素使EGFR过度表达时,则持续向细胞内传递分裂、增殖信号,导致DNA合成增加,刺激各种细胞持续生长和增殖,发生恶性转变。EGFR在头颈部鳞癌中存在过度表达,并与鳞癌发病、病理分化程度、转移及病灶复发等密切相关。

　　RNAi是近年来科学界的重要发现 , 其作为一种新兴的基因敲除技术，被广泛用于基因功能研究。RNAi的发现提供了特异性阻断基因表达的新策略，这在因某个基因表达异常增高引起的疾病中非常有用，小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA) 介导的转录后基因沉默,具有高效、特异的特点[10]。双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)进入细胞后被Dicer酶识别并切割成21～23个核苷酸的siRNA。siRNA与RNA介导的沉默复合物(RNA induced silencing complex,RISC) 结合,识别并降解同源基因mRNA,进而抑制目的基因表达[6]。

　　关于EGFR的研究开展得已经非常广泛，但运用RNAi技术来抑制肿瘤细胞EGFR表达的报道却很少。Nagy等[11]利用EGFR siRNA成功将表皮样癌细胞A431 erbB1表达水平下降90%，这是对EGFR进行RNAi的首次报道。Zhang等[12]运用在体外化学合成的EGFR序列特异性dsRNA，针对肺癌细胞A549细胞的EGFR基因瞬时沉默，使A549细胞生长和侵袭能力明显降低，但是这种方式进入细胞内的siRNA易被降解而无法持久地沉默EGFR表达。为获得持久沉默EGFR的效果，可以通过质粒把shRNA转染入细胞并使得shRNA融入人细胞基因组，利用细胞基因组的复制而复制，持续产生siRNA，长久地降解EGFR的mRNA。利用质粒或病毒作为载体、借助 RNA 聚合酶 Ⅲ启动子 (如U6 、H1) 启动外源 DNA 在细胞内转录表达 shRNA ,进一步切割产生 siRNA 。质粒介导的 shRNA表达法操作简便 ,可稳定而持久地抑制靶基因表达。质粒介导的细胞转染效率较病毒介导的低 ,可能会影响基因沉默效果 ,但采用筛选稳定转染细胞克隆则可克服质粒介导的细胞转染效率相对较低的问题。

　　本实验采用空载体PGPU6/GFP/Neo，这种质粒专门用于RNAi实验，它带有的U6启动子有强大的功能，在U6 启动子的作用下，转录产生shRNA, 其发卡环结构被切除后产生的siRNA,具有表达量多、持续时间久的优点;并且经证实以9个核苷酸序列环为发卡的shRNA产生的抑制效应最强;通过抗性辅助筛选,重组体被整合到宿主细胞基因组后,RNA干扰效应可以传代。另外，带有卡那霉素抗性基因，可用于真核细胞转染后筛选单克隆细胞。Bai等[13]运用质粒载体介导的shRNA靶向干扰EGFR来治疗肺腺癌已经取得满意效果。表达载体显著下调EGFR表达，被干扰的肿瘤细胞出现G1期阻滞、生长抑制及凋亡增加的现象。认为siRNA介导的EGFR表达抑制可能成为治疗肿瘤的一种有效方法。

　　本实验成功构建了4条针对EGFR的shRNA真核表达载体，4条干扰片段能保证至少1条有较高的干扰效率，并分别用脂体质Lipofectamine 2000转染Colo-16细胞，用卡那霉素筛选得到稳定生长的单细胞克隆，为下一步观察其沉默EGFR的表达及抑制肿瘤细胞增殖等打下稳固的基础。本研究结果也证实了我们构建的表达载体可以进行稳定转染,重组体可以整合到Colo-16细胞，为皮肤鳞状细胞癌的基因治疗提供新的途径。

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