反义寡核苷酸转染A375细胞实验条件的优化

　　作者：王梅　王冰　谭升顺 作者单位：西安交通大学医学院：第二附属医院皮肤科，陕西西安 710004;病理系，陕西西安 710061

　　【摘要】目的 研究不同的转染条件下，Survivin反义寡核苷酸(ASODN)对体外培养的人恶性黑色素瘤细胞A375生长的影响。方法 通过对ASODN进行硫代修饰、脂质体运转及培养条件的改变，用倒置显微镜、台盼蓝计数观察Survivin ASODN对A375细胞增殖的抑制作用。结果 硫代修饰ASODN经脂质体包裹对细胞生长抑制作用明显强于未经脂质体包裹组(P<0.01);②细胞培养6h贴壁后进行转染对细胞的生长抑制率明显高于24h后进行转染(P<0.05);③转染期间(4h)无血清存在组与相应对照组比较差异有显著性意义(P<0.01);④ASODN转染后12-72h，对细胞的抑制效应逐渐升高，72h达顶峰，之后开始回落;⑤与混杂组(SODN)及错配组(MODN)相比，反义组在各个浓度对细胞生长抑制作用最明显，各浓度组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 许多因素影响ASODN的转运，不同的实验应选择不同的实验优化条件。

　　【关键词】 survivin;恶性黑色素瘤;反义寡核苷酸;脂质体;细胞培养

　　Experimental studies of optimized transfection condition on human　malignant melanoma cell by survivin antisense oligonucleotide

　　Wang Mei, Wang Bing, Tan Shengshun

　　(Department of Dermatology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of　Xian Jiaotong University, Xian 710004; Department of Pathology,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective To observe effects of survivin antisense oligonucleotide on proliferation of human malignant melanoma cell in vitro in different transfection condition. Methods By using trypan blue exclusion method, this study screened optimized transfection condition that inhibited A375 cell viability. Results ① By the phosphorothiotemodification and the liposomeencapsulation, there were significant differences in ASODN with ASODNL. ASODNL were stronger in inhibiting A375 cell proliferation (P<0.01). ② 6 hours after plating, antisense oligonucleotide transfected A375 cell, growth suppression rate of cells was higher than 24h. ③ During 4h transfection, compared to the serumpresent group, the serumfree group had greater effect on the cell growth (P<0.01). ④ The inhibitory effect of ASODN gradually rose at 12-72h after transfection, 72h reached the peak, and after that the inhibitory rate began to fall. ⑤ Compared with MODN and SODN, ASODN at distinct concentration had the highest inhibition on the cell growth, and there were significant differences in different groups (P<0.01). Conclusion Many factors influenced antisense oligonucleotide uptake in vitro. Different experiment should select different optimal transfection condition.

　　KEY WORDS: survivin; malignant melanoma; antisense oligonucleotide (ASODN); liposome; cell culture

　　反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASODN)由于作用特异性高、设计合成简单、费用低，已广泛用于封闭在肿瘤发病中起关键作用的基因，并已取得了实验室阶段的初步成功。目前ASODN在细胞内转运面临严重的挑战。ASODN长度、序列、修饰、运转载体、细胞类型、培养液和培养条件都影响ASODN的细胞内摄取。本研究通过观察对凋亡抑制蛋白Survivin ASODN进行硫代修饰、脂质体包裹及改变不同的培养条件后，对人恶性黑素瘤细胞增殖的影响，探讨ASODN作用优化的实验条件。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞系 A375细胞系组织来源为人皮肤恶性黑色素瘤，上皮样贴壁生长，购于第四军医大学口腔医院口腔生物学教研室。

　　1.2 ASODN设计合成 Survivin ASODN序列设计参照文献[1]，由18个碱基组成，设混杂链和3个碱基错配链作为对照，经微机检索与已知人类基因无同源性。ASODN链：5′TGT GCT ATT CTG TGA ATT 3′;混杂链：5′TAA GCT GTT CTA TGT GTT3′，错配链：5′TGT GCT ACT CGC TGA ATT 3′。以上3条寡核苷酸链全硫代磷酸化修饰，由上海生工生物公司合成。

　　1.3 主要试剂 Oligofectamine转染试剂购自Invitrogen公司;Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline phosphatase购自Promega公司;羊抗人Survivin多克隆抗体sc8806购自Santa Cruz公司;碱磷酶标记兔抗山羊IgG购自中山生物公司;其他试剂购自华美生物公司。

　　1.4 溶液配置 无菌条件下配制A液、B液和C液。A液：无血清无抗生素培养基适量溶解ASODN，室温下静置30min;B液：脂质体加入适量无血清无抗生素培养基中，放置5-10min。C液：将A液与B液轻轻混合，室温孵育15-20min。

　　1.5 方法

　　1.5.1 Oligofectamine对ASODN转染的影响 实验分2组：ASODN组：ASODN转染细胞;ASODNL组：Oligofectamine携带ASODN转染细胞。ASODN设5、10、20、30和40μmol/L 5个组，ASODNL组所需相应脂质体分别为0.5、1、2、3、4μL/mL，终浓度为1mL/L的10μmol/L oligo。设置正常细胞和脂质体对照组，对照组及各实验组每个浓度复设4孔。取生长状态良好的细胞1瓶，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，以4×104/mL接种于24孔板中，37℃，5%(体积分数)CO2及饱和湿度环境下培养6h，准备转染。ASODN各浓度组细胞中加A液，使ASODN终浓度为5、10、20、30和40μmol/L。ASODNL各浓度组细胞加C液，寡核苷酸终浓度同上，脂质体终浓度为1mL/L的10μmol/L oligo。脂质体对照组每孔加B液，内含与ASODNL各浓度组相同浓度的脂质体。转染后72h，收集各孔细胞，分析结果。

　　1.5.2 不同转染条件对ASODN作用的影响 实验分4组：实验1：细胞培养24h后转染;实验组2：细胞培养6h后转染;实验组3：细胞培养6h后转染，转染期间4h无血清阻断期;实验组4：细胞培养24h后转染，转染期间4h无血清阻断期。各实验组以相同条件下不加处理因素设置各自对照组。ASODN设5、10、20、30μmol/L 4个组，各组所需相应脂质体终浓度为1mL/L的10μmol/L oligo。每个浓度组复设4孔。转染后72h，收集各孔细胞，分析结果。

　　1.5.3 不同作用持续时间对ASODN转染效率的影响 实验分5组，分别于ASODN转染后12、24、48、72、96h收集细胞，分析结果。ASODN作用浓度为20μmol/L，脂质体终浓度为1mL/L的10μmol/L oligo。每个时间段复设4孔，并设4孔正常细胞对照。

　　1.5.4 ASODN作用的序列特异性 实验分4组：对照组及反义、混杂和错配ODN处理组。各个处理组设5、10、20、30μmol/L 4个浓度。对照组和处理组各个浓度复设4孔。培养6h细胞贴壁后行3条寡核苷酸链脂质体携带转运，无血清阻断4h后，恢复10%(体积分数)胎牛血清(fetal calf serum, FCS)培养条件。转染后72h收集细胞，观察3条寡核苷酸链对细胞生长的影响。

　　1.6 Western blot法 检测A375细胞中Survivin蛋白的表达，具体实验方法包括培养细胞的裂解、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质的电转移及免疫印迹参照文献[2]进行。

　　1.7 台盼蓝排斥试验 实验操作过程参见文献[3]，计数活细胞数，每孔重复计数3次。每毫升原液中细胞数=(4大格细胞总数/4)×104，转染寡核苷酸后，细胞生长抑制率计算公式为：抑制率=(对照组细胞计数-处理组细胞计数)/对照组细胞计数×100%。

　　1.8 统计学处理 数据均采用均数±标准差表示，应用t检验进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 人恶性黑色素瘤细胞Survivin的表达 Western blot检测A375细胞中Survivin蛋白的表达，与蛋白Marker相比较，可见A375细胞中一分子质量约为16.5ku的特异条带出现(图1)。

　　2.2 Oligofectamine对ASODN的影响

　　2.2.1 不同浓度Oligofectamine对细胞生长的影响 脂质体以1mL/L的10μmol/L oligo终浓度作用于A375细胞72h，对细胞存活无明显影响，最高抑制率仅3.34%。各组与对照组相比，差别无统计学意义(P>0.05，表1)。

　　图1 A375细胞中survivin 蛋白的表达(略)

　　Fig.1 The expression of survivin protein in A375 cell

　　A: 16.5ku survivin band; B: protein marker

　　表1 Oligofectamine对A375细胞生长的影响(略)

　　Table 1 The effect of oligofectamine on A375 cell proliferation

　　2.2.2 Oligofectamine介导ASODN转染对细胞生长的影响 不同浓度ASODN经脂质体携带转染A375细胞，转染后72h细胞计数。在实验设置各浓度点上，ASODNL对细胞生长抑制作用均高于ASODN组，在10、20μmol/L两个浓度时段上两组之间差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

　　表2 脂质体介导转染对ASODN作用的影响(略)

　　Table 2 The effect of ASODN on A375 cell proliferation by oligofectamineencapsulation

　　Control group cell count: 68.8±5.7;*P<0.05 vs. ASODN group

　　2.3 Oligofectamine转染条件优化 各实验组分别在转染后72h，计数细胞并与相同条件下对照组相比计算细胞生长抑制率。细胞培养24h后转染和培养6h后转染，转染期间(4h)无血清存在组与相应组比较差异均有显著性意义(P<0.05)。无血清阻断实验条件下，细胞培养6h贴壁后进行转染对细胞的生长抑制率明显高于24h后进行转染，两组间差异有统计学意义(P<0.05，表3)。因此，选择细胞培养6h贴壁后进行转染及转染期间不存在血清为实验优化条件。合适的寡核苷酸作用浓度应能抑制A375细胞生长达50%以上(与对照组相比)。本实验中，经脂质体携带培养6h转运并无血清阻断4h的实验条件下，20、30μmol/L ASODN对 A375细胞的生长抑制均超过50%。细胞计数(×104/mL)：对照组：63.3±5.6;20μmol/L：30.5±4.5;30μmol/L：27.0±5.0。

　　表3 不同转染条件对A375细胞生长抑制率的影响(略)

　　Table 3 The effect of ASODN on inhibitory rate of A375 cell growth under different transfection conditions

　　*P<0.05 vs. 10%FCS+24h; △P<0.05 vs. 10% FCS+6h; #P<0.05 vs. 10% FCS+24h+serumfree

　　2.4 ASODN在不同作用时点对A375细胞生长的影响 20μmoL/L的反义寡核苷酸经脂质体介导转染A375细胞，在不同作用时段对细胞生长的抑制率为：10.9%、27.8%、44.2%、51.4%、40.1%。抑制效应从12h开始出现，逐渐升高，转染后72h抑制细胞增殖作用最强，然后缓慢下降。在一定时间段内，作用呈现时间依赖效应，超出这个时间段，抑制率反而下降(图2)。

　　图2 ASODN在不同作用时点对A375细胞生长抑制率的影响(略)

　　Fig.2 The effect of different ASODN transfection time on inhibitory rate of A375 cell growth

　　2.5 ASODN作用的序列特异性 ASODN处理组在各个浓度对细胞生长抑制作用最明显，分别为23.2%、40.7%、51.7%、57.6%，明显高于混杂组及错配组，各浓度组比较差异有显著性意义(P<0.05)。混杂及错配两组在实验浓度范围内对细胞生长抑制未超过20%(表4)。

　　表4 3种硫代修饰寡核苷酸对A375细胞生长抑制率的影响(略)

　　Table 4 The effect of three PSODN on inhibitory rate of A375 cell growth

　　Control group cell count: 59.0±7.1 ; *P<0.05, **P<0.01 vs. ASODN group

　　3 讨论

　　凋亡抑制蛋白survivin与许多肿瘤恶性增殖和对传统放化疗抵抗相关。Grossman等[4]通过Western 印迹证明survivin在4个人转移性恶性黑色素瘤细胞系中表达，而在培养的正常人黑色素细胞中不表达。Survivin在A375细胞中表达情况未见文献报道。本实验经Western blot方法证实A375细胞中存在凋亡抑制蛋白survivin的再活化表达，理论上通过ASODN抑制或封闭survivin基因表达，可达到基因控制和肿瘤治疗的目的。

　　但ASODN细胞内转运面临药物稳定性和如何有效通过细胞膜的挑战。预实验中按文献提供的方法和寡核苷酸浓度，未观察到明显的细胞抑制现象，推测与ASODN易受核酸酶降解，难以有效进入细胞内有关。实验中我们将合成的ASODN进行硫代磷酸化修饰，以Oligofectamine试剂作为运转载体。ODN通过硫代修饰后，可显著提高对核酸酶降解的抵抗能力，脂质体作为载体不仅增加寡核苷酸进入细胞内速率，同时也增加了寡核苷酸和靶mRNA的杂交速率，已成功用于不同类型寡核苷酸转运，抑制基因表达[6]。

　　实验选用的Oligofectamine试剂非常适于将寡核苷酸转染入真核细胞。在使用脂质体前，应选用最优化的转染条件，以获得最高的转染效率及最低毒性。这些条件包括：接种细胞密度，脂质体及寡核苷酸浓度。文献报道不同细胞接种密度对于ASODN抑制效应有影响。许多研究证明，分裂细胞比未分裂细胞更容易摄取ODN。我们在预实验中设置了5个不同细胞接种密度组，发现细胞密度过高和过低都对ODN的摄取不利，只有在合适的细胞接种密度3-4×104/mL时反义寡核苷酸才能发挥最大抑制效应。推测细胞接种密度过低，细胞生长状态不良;接种密度过高，细胞很快经对数生长期进入增殖稳定期;细胞增殖过快，ASODN发挥药效的作用时间不够都影响药效的发挥。实验中用4×104/mL细胞接种密度，终体积分数为0.5、1、2、3、4μL/mL脂质体作用于细胞72h与对照组相比对细胞生存无影响。观察硫代修饰及经上述浓度脂质体包裹不同浓度的反义寡核苷酸作用于细胞72h，证实脂质体携带转运使ASODN在实验的各浓度组对细胞的生长抑制作用明显强于未经脂质体介导组。说明天然寡核苷酸经过骨架修饰获得稳定性提高，经脂质体转运易于进入细胞内作用部位，极大改善了ASODN生物活性效应。而且，经脂质体包裹的ASODN随作用浓度的增高对细胞生长抑制率增加。证明在实验设置浓度范围内的寡核苷酸以终体积分数为1μL/mL脂质体携带均能获得较高的转染效率及较低毒性。

　　ASODN长度、序列、细胞类型、培养液和培养条件都影响ASODN的细胞内摄取，前3种因素在本实验中是固定的，故从后两方面来优化实验条件。为控制开始转染的时间，细胞接种后24h和接种后6h分别转染硫代修饰的ASODN，发现细胞培养6h贴壁后进行转染，效率高于24h后转染。可能细胞处于潜伏期时对ASODN转染更为敏感。随后我们研究在转染期间血清存在与否对转染效果的影响。研究证实[7]脂质体核苷酸复合物与细胞共培养期血清存在降低了转染效率，可能由于阴性电荷的血清组分粘附于复合物，阻止了细胞内整合作用。Wang等[8]研究发现，FolatePEG脂质体复合物包埋的反义PSODN在37℃下处理4h后，PSODN主要分布在细胞表面和细胞质液泡中，而处理24h后，PSODN则完全进入细胞质中，其中一些富集在核内。据此，我们设置硫代修饰ASODN经脂质体携带转运时4h无血清转染期，观察在10%(体积分数)胎牛血清培养条件下，分别于接种细胞后6h和24h转染ASODN，4h转染期间无血清无抗生素存在，与相同条件下转染期间有血清存在的两组相比，对细胞抑制率均高于对方。尤以细胞接种6h后无血清转染效果最佳。在上述优化的转染条件下，观察不同浓度硫代ASODN在转染后的不同时间对细胞的生长抑制情况，可以看出，在转染后12-72h，对细胞的抑制效应逐渐升高，72h达顶峰，之后开始回落。这种生物活动效应可能与反义活动特异性阻断mRNA水平调节机制相一致。

　　在对不同实验条件优选中发现，3×104-4×104/mL密度接种细胞6h后，20μmol/L survivin反义寡核苷酸ASODN经硫代修饰、脂质体(脂质体终体积分数为1μL/mL)包裹无血清转染细胞4h，在转染后72h对细胞可达到半数抑制效应，明显高于混杂及错配组，两控制组对细胞生长抑制率不超过20%。通过实验证明ASODN能特异性抑制survivin基因的表达，仅存在轻度非特异性作用。近几年，反义寡核苷酸是基因治疗领域的研究热点。在体外细胞实验中，应根据不同的细胞类型、寡核苷酸、培养条件作大量的预实验选择最佳转染条件，照搬参考文献提供的转染条件，可能得不到预期的实验结果。

　　【参考文献】

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　　[7]Ulrich AS. Biophysical aspects of using liposomes as delivery vehicles [J]. Biosci Rep, 2002, 22(2):129150.

　　[8]Wang S, Lee RJ, Cauchon G, et al. Delivery of antisense oligodeoxyribonucleotides against the human epidermal growth factor receptor into cultured KB cells with liposomes conjugated to folate via polyethyleneolycol [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92(8):33183322.