依曲替酸对角质形成细胞肝素结合表皮生长因子样生长因子mRNA的影响

　　作者：罗素菊，彭振辉，郑焱，张路坤，王蔚，王国荣 作者单位：(西安交通大学医学院第二附属医院：皮肤科;泌尿外科，陕西西安 710004;陕西省人民医院普通外科，陕西西安 710068)

　　【摘要】 目的 研究依曲替酸对培养的正常人角质形成细胞(KC)增殖和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HBEGF)mRNA表达的影响。方法 0.1和1μmol/L伊曲替酸处理正常人KC 12h后，用噻唑蓝比色法(MTT法)和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法分别检测KC增殖和HBEGF mRNA表达的改变。结果 依曲替酸处理12h后，可剂量依赖抑制KC的增殖和上调HBEGF mRNA的表达。0.1和1μmol/L伊曲替酸分别使KC增殖抑制10.2%和14.4%，使HBEGF mRNA增加到正常对照组的3.2和7.1倍。与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 依曲替酸可剂量依赖上调HBEGF mRNA的表达，其可能参与依曲替酸对KC增殖的抑制作用。

　　【关键词】 表皮生长因子;角质形成细胞;维甲酸

　　Effect of acitretin in inducing the expression of heparinbinding epidermalgrowthfactorlike growth factor mRNA in normal human keratinocytes

　　Luo Suju, Peng Zhenhui, Zheng Yan, Zhang Lukun, Wang Wei, Wang Guorong

　　(Department of Dermatology; Department of Urinary Surgery, the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004; Department of　Gastroenterology, Shaanxi Provincial Peoples Hospital, Xian 710068, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the alteration of cell proliferation and heparinbinding epidermalgrowthfactorlike growth factor(HBEGF)mRNA expression in cultured normal human keratinocytes after acitretin treatment. Methods After a 12hour incubation with 0.1 and 1μmol/L acitretin in normal human keratinocytes, the proliferation potency of the cells was detected by MTT colorimetric assay and the expression of HBEGF mRNA was examined by realtime quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR). Results Both keratinocytes growth inhibition and HBEGF mRNA expression was dosedependently induced by acitretin. Treatment with 0.1 and 1μmol/L acitretin inhibited keratinocyte proliferation by 10.2% and 14.4%, and elevated HBEGF mRNA by 3.2and 7.1fold, respectively. Conclusion Upregulated HBEGF mRNA expression induced by acitretin in normal human keratinocytes may be involved in regulating keratinocyte growth inhibition after acitretin treatment.

　　KEY WORDS: epidermal growth factor; keratinocyte; retinoid

　　维甲酸(retinoic acid, RA)是维生素A的代谢物或衍生物，具有广泛的生物学功能，包括参与调控细胞的增殖、分化和凋亡，抑制黑色素生成，抑制皮脂分泌，调节免疫功能，抗衰老等。自人工合成全反式RA后，RA已被广泛应用于多种皮肤科疾病的治疗，如角化性皮肤病、痤疮、银屑病、皮肤光老化等，并且取得了良好的疗效。通常认为RA通过两类受体发挥作用，即维甲酸受体(retinoic acid receptors, RAR)和维甲酸X受体(retinoid X receptors, RXR)，但其具体作用机制至今尚不完全清楚。体外角质形成细胞(keratinocyte, KC)培养、皮肤器官培养、皮肤活检及动物实验研究表明RA可诱导HBEGF的表达，提示RA可能部分通过调节HBEGF的表达，从而发挥其生物学功能[1]。肝素结合表皮生长因子样生长因子(heparinbinding epidermalgrowthfactorlike growth factor, HBEGF)与转化生长因子α、双向调节因子和表皮调节素等生长因子相互作用，通过旁分泌形式调节KC的增殖和分化。HBEGF先以跨膜形式合成(proHBEGF)，其外功能区脱落后形成游离形式(sHBEGF)的HBEGF。proHBEGF可抑制细胞的生长，而sHBEGF是KC、纤维母细胞、平滑肌细胞等多种细胞的有丝分裂原[2]。在表皮增生性皮肤病如银屑病、基底细胞癌、鳞状细胞癌中，HBEGF的表达升高[3]，RA处理后可逆转银屑病皮损中HBEGF的异常表达[4]，提示HBEGF在RA对KC生长和分化的调节中发挥重要的作用。因此，我们在体外用不同浓度的依曲替酸刺激培养的正常人KC，检测其对细胞增殖和HBEGF mRNA表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要仪器和试剂 KC无血清培养基(KCSFM)、低糖DMEM、Dispase酶均购于Gibco公司，依曲替酸为重庆华邦制药股份有限公司惠赠，TRIzol试剂购于Invitrogen公司，RTPCR试剂盒购于Fermentas公司，SYBR green 2×PCR混合液购于ABI公司，PCR配套试剂购于TaKaRa公司，GeneAmp 9700 PCR仪和PRISM 7900 PCR仪均为ABI公司产品。

　　1.2 原代KC的培养 取健康人环切术后包皮，消毒液浸泡后，置于2.5g/L Dispase酶4℃消化过夜。次日分离表、真皮，将表皮置于2.5g/L胰酶与0.2g/L EDTA(1∶1)混合液中，消化10min，用含100mL/L胎牛血清的DMEM终止消化，吹打后，100目筛网过滤，离心收集细胞，加入KCSFM，接种入培养瓶，于37℃、50mL/L CO2条件下培养，次日更换新培养基，以后每3d换液一次，取3-5代细胞进行实验[5]。将实验细胞传代入6孔培养板中，当细胞90%融合时，进行干预处理，继续培养12h。每组设3个孔，并设置未处理的正常对照组。

　　1.3 MTT法检测细胞的增殖 将处于对数生长期的细胞接种于96孔培养板，加入含0.1或1μmol/L依曲替酸的培养液，继续培养12h。设空白对照组(只加细胞培养液，无细胞)。吸出培养液，每孔中加入MTT(5mg/mL)后再孵育4h，弃上清液后每孔加入二甲基亚砜150μL，振荡10min。以空白对照组为基准，在490nm波长处检测吸光度值。生长抑制率(%)=1-A490nm(实验组细胞)/A490nm(对照组细胞)×100%。

　　1.4 总RNA的提取和cDNA的合成 按10cm2(培养瓶面积)加入1mL TRIzoL提取总RNA，操作严按试剂盒说明进行。用12g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性，用紫外分光光度计测RNA含量和纯度。cDNA的合成操作严格按试剂盒说明进行。

　　1.5 实时荧光定量RTPCR检测HBEGF mRNA的表达 用10倍比稀释βactin基因的PCR扩增产物做相对定量的标准品。实时定量PCR反应体系为25μL，包括：模板cDNA 2μL，SYBR Green 2×PCR混合液12.5μL，H2O 8.5μL，上游和下游引物(βactin或HBEGF)各1μL。扩增条件为：50℃ 2min，95℃ 10min，然后95℃ 30s，60℃ 1min，循环40次。HBEGF上游引物序列：GGCTCCCTCCTGCATCTG，下游引物序列：AGGATGGTTGTGTGGTCATAGGT，产物105bp;βactin上游引物序列：CAGCACAATGAAGATCAAGATCA，下游引物序列：CGTCATACTCCTGCTTGCTGA，产物125bp。在PCR过程中设立无模板阴性对照。在实验结束后进行溶解曲线分析，以鉴定产物是否单一。

　　1.6 统计学处理 用2-△△Ct法处理实时荧光定量RTPCR数据，所得结果即表示目的基因相对于正常对照组所改变的倍数[6]。统计学分析采用SPSS11.5软件进行Dunnettt检验，数据用±s表示，P<0.05则认为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 依曲替酸对KC增殖的影响 依曲替酸可剂量依赖抑制KC的生长，0.1和1μmoL/L伊曲替酸分别使KC的生长抑制10.2%和14.4%(表1)。

　　表1 依曲替酸对KC增殖的影响(略)

　　Table 1 Effects of acitretin on the proliferation of keratinocytes

　　**P<0.01 vs. control

　　2.2 总RNA纯度及质量鉴定 经测定A260/280比值在1.7-1.9之间，表明RNA无污染，电泳显示5s、18s和28s三条带，说明RNA完整性较好。

　　2.3 实时荧光定量RTPCR检测依曲替酸对HBEGF mRNA的影响 标准品的扩增曲线见图1。待测标本的Ct值均在标准曲线内，说明所测值可信。溶解曲线分析无明显非特异峰形成，说明无明显非特异性扩增。依曲替酸可剂量依赖诱导HBEGF mRNA的表达，0.1和1μmoL/L处理后分别使HBEGF mRNA增加到正常对照组的3.2和7.1倍(图2)。

　　图1 标准品的扩增曲线(略)

　　Fig.1 Amplification curve of standard sample

　　图2 依曲替酸对HBEGF mRNA的影响(略)

　　Fig.2 The expression of HBEGF mRNA was elevated by 3.2 and 7.1 fold after treatment with 0.1 and 1μmoL/L acitretin *P<0.05 vs. control

　　3 讨论

　　依曲替酸处理后，可剂量依赖抑制KC的增殖和上调HBEGF mRNA的表达。以往的研究表明RA对细胞的生长有双重调控作用，在其浓度低于0.1μmoL/L时可刺激KC的增殖，而高于此浓度时则抑制KC的增殖[7]。但是，在此实验中我们观察到0.1μmoL/L依曲替酸已明显抑制KC的增殖，可能是在实验中所用的RA药物不同所致。HBEGF是RA受体所调控的主要靶基因，其与其他细胞因子相互作用调节KC的增殖和分化。HBEGF与EGF受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)和ErbB4结合，诱导EGFR磷酸化，并启动细胞活化信号，调节细胞的生长，使细胞维持于稳定的增殖分化状态。proHBEGF在基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease, MMP)和解聚素金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease, ADAM)的介导下，外功能区脱落，形成sHBEGF[8]。体外研究表明，proHBEGF有抑制生长的活性，而sHBEGF有刺激生长的作用[2]。RA可下调MMP如MMP7的表达[9]。因此，我们假设，当proHBEGF表达轻度增加时，可在MMP 和ADAM的充分作用下转化生成更多的sHBEGF，从而刺激邻近细胞的生长，而当proHBEGF的表达明显高于上述水平时，其未能充分转化为sHBEGF，而使增多的proHBEGF与EGFR结合后通过旁分泌作用抑制邻近细胞的生长。生长因子对细胞生长有双重调节作用，其既可通过激活丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3kinase, PI3K)通路促进细胞生长，又可通过信号转导和转录活化蛋白(signal transducers and activators of transcription, STAT)诱导的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物p21waf1和caspase 1而导致细胞生长停滞或死亡[10]。正常情况下，STAT诱导的p21waf1和MAPK活性处于平衡状态，而维持细胞的正常生长[11]。当这两种信号途径的平衡状态被破坏时，细胞发生过度生长或凋亡。HBEGF与EGFR结合后可同时激活生存信号途径和凋亡信号途径[1213]。因此，我们假设，HBEGF表达轻度增高时，被激活的生存信号强于死亡信号，而刺激KC的生长;当HBEGF高水平表达时，激活的死亡信号强于生存信号，而抑制KC的生长，诱导其凋亡。总之，HBEGF通过旁分泌与EGFR结合，使EGFR活化，随后激活不同的信号途径，而刺激或抑制KC的生长。总之，依曲替酸可剂量依赖上调HBEGF mRNA的表达，其可能参与调节依曲替酸对KC增殖的抑制作用。这对依曲替酸治疗表皮增生性皮肤病的机制有一定的提示作用。关于RA调节KC增殖的分子机制还需进一步研究。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30371295,30400387);陕西省自然科学基金资助项目(No.2004C211)

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