Survivin反义寡核苷酸增加A375细胞对顺铂的敏感性

　　作者：王梅，王晓丽，王冰，谭升顺 作者单位：西安交通大学医学院：1. 第二附属医院皮肤科，陕西西安 710004;2. 第一附属医院肿瘤科，陕西西安 710061;3. 病理系，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 研究Survivin反义寡核苷酸对人恶性黑色素瘤A375细胞顺铂治疗敏感性的影响。方法 台盼蓝计数观察Survivin反义寡核苷酸和顺铂对A375细胞增殖的抑制作用。结果 5μmol/L反义寡核苷酸与0.5mg/L顺铂共同作用于A375细胞72h，细胞生长抑制率为61.3%，高于单因素作用组，组间比较差异具有统计学意义(P<0.001)。用反义寡核苷酸预处理细胞24h后加入顺铂对A375细胞的生长抑制率为68.0%，高于同时用药组，但组间差异无统计学意义。结论 反义寡核苷酸和顺铂联合用药对A375细胞生存具有协同抑制效应，即Survivin反义寡核苷酸可增强A375细胞对顺铂治疗的敏感性。

　　【关键词】 Survivin;顺铂;恶性黑色素瘤;细胞凋亡

　　基金项目：陕西省科技攻关基金资助项目(No. 2003 K10G10)

　　ligonucleotide sensitizes A375 cells to cisplatin

　　Wang Mei, Wang Xiaoli, Wang Bing, Tan Shengshun

　　1. Department of Dermatology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of　Xian Jiaotong University, Xian 710004;

　　2. Department of Oncology,

　　the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004;

　　3. Department of Pathology, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China

　　ABSTRACT: Objective To investigate whether targeting survivin has the potential to sensitize A375 cells to chemotherapy. Methods By trypan blue exclusion assays we observed A375 cell proliferation inhibition induced by survivin antisense oligonucleotide (ASODN) and cisplatin. Results A375 cells treated with a combination of 5μmol/L ASODN and 0.5mg/L cisplatin, and approximately 61.3% of the cells showed signs of cell death 72h after the start of transfection trypan blue exclusion assays. Compared to treatments with either oligonucleotide or cisplatin alone, there were significant differences among the groups(P<0.001). Cells were pretreated 24h with 5μmol/L ASODN before combination treatment, and 68.0% of the cells showed signs of cell death, but there were not significant differences between combination treated group and pretreated group. Conclusion A combination treatment with ASODN and cisplatin possesses synergy in inhibiting A375 cell proliferation, indicating that oligonucleotide sensitizes A375 cells to cisplatin therapy.

　　KEY WORDS: survivin; cisplatin; malignant melanoma; cell apoptosis

　　皮肤恶性黑色素瘤对传统放、化疗都有抵抗作用，播散期患者预后很差，5年生存率仅为10%-50%。多数研究者认为，较之其他恶性肿瘤，恶性黑色素瘤对治疗抵抗更可能与凋亡抑制有关[1]。最近研究发现凋亡抑制蛋白Survivin在肿瘤对传统治疗抵抗方面起重要作用，其过表达有助于细胞逃逸化学治疗和放射治疗诱导的G2/M期凋亡检查点，促进肿瘤对放化疗的抵抗作用[2]。本研究通过Survivin反义寡核苷酸作用于人恶性黑色素瘤A375细胞，观察A375细胞对顺铂治疗敏感性的改变，初步探讨Survivin基因在恶性黑色素瘤治疗抵抗中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞系

　　A375细胞系组织来源为人皮肤恶性黑色素瘤，上皮样贴壁生长，购于第四军医大学口腔医院口腔生物学教研室。

　　1.2 反义寡核苷酸(ASODN)的设计合成

　　Survivin ASODN 序列设计参照文献[3]，由18个碱基组成，设混杂链(scramble oligonucleotide, SODN)和3个碱基错配链(mismatch oligonucleotide, MODN)作为对照，经微机检索与已知人类基因无同源性，序列如下：ASODN链5′TGT GCT ATT CTG TGA ATT 3′;SODN链5′TAA GCT GTT CTA TGT GTT3′;MODN链5′TGT GCT ACT CGC TGA ATT 3′。以上3条寡核苷酸链全硫代磷酸化修饰，由上海生工生物公司合成。

　　1.3 主要试剂

　　Oligofectamine转染试剂(Invitrogen公司);胰蛋白酶(Sigma公司);台盼蓝(华美生物公司);顺铂(山东齐鲁制药厂);PRMI1640培养基(Gibco公司)。

　　1.4 溶液配置

　　顺铂(DDP)：注射用生理盐水稀释成1g/L药物母液备用;寡聚核苷酸：使用前短暂离心，无血清无双抗培养液溶解，充分振荡，室温下静置30min;脂质体：使用时加入适量无血清无抗生素培养基中，放置5-10min。

　　1.5 实验分组

　　实验分7组：①对照组;②ASODN处理组;③DDP处理组;④ASODN+DDP处理组;⑤SODN+DDP处理组;⑥MODN+DDP处理组;⑦ASODN预处理24h+DDP。实验寡核苷酸终质量浓度为5μmol/L，脂质体终浓度为1mL/L。顺铂终质量浓度为0.5mg/L。

　　1.6 细胞准备

　　取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，以4×104/mL细胞密度接种于24孔板内，每个实验组复设4孔。常规培养6h后，倒掉培养液，无血清无双抗培养液洗细胞1次。各实验组具体操作步骤如下：①对照组，每孔加0.66mL无血清培养液孵箱内置4h，加0.34mL含3倍正常血清的培养液;②ASODN处理组，每孔33μg反义寡核苷酸，1μL脂质体，0.66mL无血清培养液溶解，混匀室温静置15-20min，加入每孔中，培养4h后补加0.34mL含3倍正常血清的培养液;③DDP处理组，加0.66mL无血清培养液孵箱内置4h，加0.34mL含3倍正常血清的培养液及顺铂使其终质量浓度为0.5mg/L;④ASODN+DDP处理组，②+③;⑤SODN+DDP处理组，实验步骤同④，将反义寡核苷酸换成混杂链;⑥MODN+DDP处理组，实验步骤同④，将反义寡核苷酸换成错配链;⑦ASODN预处理24h+DDP，转染步骤同②，在转染后24h加入顺铂使其终质量浓度为0.5mg/L。以上7组均在转染后72h收获细胞，测定细胞增殖抑制情况。

　　1.7 台盼蓝排斥试验

　　24孔板每孔加0.2mL胰酶轻摇几下弃去，再加0.4mL胰酶消化后，加台盼蓝(4g/L)0.1mL，充分混匀后计数活细胞数，每孔重复计数3次。细胞生长抑制率=(对照组细胞计数-处理组细胞计数)/对照组细胞计数×100%。

　　1.8 统计学处理

　　数据均采用均数±标准差(±s)表示。应用单因素方差分析、独立样本t检验进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 反义寡核苷酸与顺铂对人恶性黑色瘤细胞A375的协同作用

　　各组间结果如表1所示。5μmol/L反义寡核苷酸与0.5mg/L顺铂共同作用于A375细胞72h，细胞生长抑制率为61.3%，高于单用反义寡核苷酸的23.4%及单用顺铂的16.7%，各组间比较差异具有统计学意义(P<0.001，图1)。反义寡核苷酸混杂链和错配链与顺铂联合用药与单用顺铂对细胞生长抑制率的影响不大，组间比较差异无统计学意义。表1 反义寡核苷酸与顺铂联合用药对A375细胞生长抑制的影响(略)

　　2.2 反义寡核苷酸预处理细胞对顺铂作用的影响

　　反义寡核苷酸预处理细胞24h后，加入顺铂，共同作用于细胞48h对A375细胞的生长抑制率为68.0%，高于未经预处理组61.3%。但经独立样本t检验分析，两组间差异无统计学意义。

　　3 讨 论

　　绝大多数化疗药物和放射治疗以时间剂量依赖方式最终通过凋亡的介入而起作用。诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物杀死肿瘤细胞的一种重要途径。凋亡路径的缺陷或凋亡调节基因功能紊乱可能导致化疗药物介导的凋亡抑制，引起肿瘤耐药[4]。

　　传统放化疗治疗皮肤恶性黑色素瘤的疗效一直不理想，缓解率很低，播散性黑色素瘤预后极差。由于其固有的特性，许多研究者认为，恶性黑色素瘤对治疗抵抗更可能与凋亡抑制有关[1]。Heere等[5]认为凋亡调节基因在肿瘤细胞化学治疗敏感性方面起重要作用，抗凋亡基因BclxL稳定转染的黑色素瘤细胞明显降低了顺铂诱导的细胞凋亡，相反，BclxL反义寡核苷酸治疗增加了化疗介导的细胞凋亡，据此认为，BclxL过表达对人恶性黑色素瘤化学抵抗起重要作用。还有研究发现，恶性黑色素瘤化学抵抗与Bcl2过表达有关，Bcl2反义寡核苷酸降低Bcl2表达，增加了肿瘤细胞凋亡，导致肿瘤对化学治疗敏感性增强[6]。

　　最近研究发现凋亡抑制基因Survivin在肿瘤对传统治疗抵抗方面起重要作用。胰腺癌细胞经X线照射后，Survivin mRNA表达逐步升高，X线治疗后，Survivin高表达的肿瘤细胞克隆形成率明显高于Survivin弱表达的肿瘤细胞，可见，恶性细胞通过表达高水平Survivin，可在化学治疗或放射治疗等细胞毒性状况下生存，从而获得化学抵抗[7]。在对食管癌化学治疗敏感性的研究中，对治疗部分反应的患者Survivin mRNA水平明显低于对治疗无效和进展期患者[8]。由于Survivin高表达与肿瘤细胞放化疗抵抗密切相关，靶向Survivin可改善肿瘤细胞对于治疗的敏感性。Olie等[3]用Survivin反义寡核苷酸转染肺腺癌细胞系，介导了凋亡，使肿瘤细胞对化学治疗敏感性升高。Thr34→Ala Survivin阴性突变体稳定转染人恶性黑色素瘤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡，增加了细胞对顺铂化学治疗敏感性[9]。由于Survivin在恶性黑色素瘤中几乎100%高表达，而在正常黑色素细胞中则未见其表达[10]，所以Survivin在黑色素瘤药物抵抗方面更应该受到极大关注。顺铂是用于恶性黑色素瘤化学治疗的一线药物，属于铂类配合物，作用机制是将氯解离成双矛状，与DNA双链上的碱基形成交叉连接，引起DNA链间交联，影响DNA正常复制模板的功能，从而抑制细胞分裂。本研究结果显示，Survivin反义寡核苷酸和顺铂联合用药对A375细胞生存具有协同抑制效应，即Survivin反义寡核苷酸可增强顺铂对A375细胞的敏感性。反义寡核苷酸预处理细胞24h后和顺铂共同作用对A375细胞生长抑制率为68.0%，高于同时作用组，推测由于反义寡核苷酸预处理后，Survivin表达降低，更敏感于顺铂诱导的凋亡发生。

　　研究结果表明凋亡抑制基因Survivin过表达可能与恶性黑色素瘤化学治疗抵抗有密切关系。 Survivin反义寡核苷酸能够抑制Survivin表达，重建正常的凋亡途径，从而特异性增强人恶性黑色素瘤细胞对顺铂治疗的敏感性。以小剂量化疗药物可达到对肿瘤细胞较大的杀伤力，最大限度保护正常细胞，为改进恶性黑色素瘤治疗抵抗、提高生存率提供了一条新的治疗途径。

　　【参考文献】

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