七例多囊肾患者及其家属PKD基因突变分析

　　作者：魏玫都　曾皓琛　马云霞　李雪静　高晓琴　张俊伟　张全斌　周永安 作者单位：030009太原市中心医院肾内科(魏玫都、曾皓琛、高晓琴、张俊伟)，中心实验室(马云霞、张全斌、周永安);山西医科大学2009级临床检验学(李雪静)

　　【摘要】 目的　研究太原市中心医院肾内科收集的7例多囊肾患者及其家属外周血PKD基因的突变情况。方法　采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增PKD1和PKD2部分外显子，PCR产物直接测序，据测序图谱进行突变分析。结果　1例患者及其三个女儿PKD2的4号外显子35689位C(T)杂合突变，致使氨基酸由精氨酸突变为终止密码子，发生无义突变;7例患者及其家属均在PKD1的11、12号外显子出现杂合突变，其中27752位点位于12内含子14位，不会影响氨基酸的变化，目前还不确定是否为致病突变。11号外显子共计发现5个突变位点，其中26310、26547为同义突变，26411、26438、26495为错义突变。结论　外周血PKD基因的突变检测可作为多囊肾病症前及产前筛查有效的分子生物学诊断技术。

　　【关键词】 多囊肾，常染色体显性;　寡核苷酸序列分析;　PKD基因

　　常染色体显性遗传多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是临床常见的单基因遗传性肾病之一，在欧美国家发病率约为1/1000～1/400[1]。ADPKD具有遗传显性延迟性，主要在中年以后发病，临床表现为肾脏皮质、髓质可有多个液性囊肿形成和增大，约50%患者在60岁左右发展成终末期肾功能衰竭[2]。ADPKD可累及多个器官和系统，如发生肝囊肿、颅内动脉瘤、心脏瓣膜异常等[3]。ADPKD具有遗传异质性，已发现引起成人ADPKD的基因至少有PKD1、PKD2和PKD3三种，其中约80%～85%的患者由PKD1基因突变引起，约10%～15%的患者由PKD2基因突变引起，PKD3目前尚未定位。二者临床症状相同，但后者较前者轻，发病平均年龄晚10～20年[4]。目前影像学检测手法主要针对已发病的患者，并且无特异性治疗方法;分子遗传学技术能在产前和症状出现前从基因角度给出相对准确的诊断，因此该技术已是产前控制多囊肾发生和揭示家族遗传学规律的有效措施。本研究针对确诊的多囊肾患者及家属共26个标本，采用聚合酶链式反应法(PCR)特异性扩增PKD1基因的11～14号外显子片段以及PKD2中2～15号外显子，扩增产物直接测序分析其突变情况。

　　一、资料与方法

　　1. 样本来源：收集山西省太原市中心医院肾内科确诊的多囊肾患者及其家属(4个家系共计患病7例)共26例的血液标本，年龄10～80岁。标本的采集：由专业护士对患者采取静脉外周血2～4 ml，枸橼酸钠抗凝。

　　2. 试剂及仪器：全血DNA快速抽提试剂盒(北京索来宝科技有限公司);引物由上海基康生物技术公司合成;Eppendorf低温离心机;ABI 2720热循环仪;北京六一电泳仪及水平电泳槽;法国Vilber Infinity 3000系列凝胶成像仪。

　　3. PCR扩增：扩增引物序列见文献[5]。25 μl的反应体系：10×Buffer 2.5 μl，MgCl2 2 μl,2.5 mmol/L dNTP 3 μl,10 μmol/L 引物各 1 μl,1 U/μl Taq 酶 1 μl,100 ng DNA 模版1 μl， ddH2O 13.5 μl。上述试剂由 Takara 公司提供。反应条件：94 ℃ 3 min;94 ℃ 50 s， 65 ℃/55 ℃ 50 s,72 ℃ 30 s,35 个循环;72 ℃ 7 min。1.5%的琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。

　　4. 测序：首先所有患者各外显子的PCR扩增产物送上海英俊生物技术有限公司测序，测序发现异常者，再对其所有家属进行相同外显子测序分析。

　　二、结果

　　1. PCR扩增电泳结果：PCR 扩增产物如图1和图2所示，获得了清晰的条带，可用于后续测序。

　　2. 测序结果分析：首先对4个家系7例多囊肾患者PKD2的2～15外显子测序分析，结果如图3所示：2号家系中1例患者PKD2的4号外显子 35689 位出现 C(T) 杂合突变，随后对患者的三个女儿该外显子测序，发现三个女儿的此位点同样存在 C(T) 杂合突变;7例患者的PKD2其他13个外显子测序分析未发现碱基变化。

　　7 例患者PKD1的11～14外显子测序分析，所有患者均在11、12号外显子出现杂合突变(图4～9)，因26547位点靠近11号外显子边缘，故反向测序未能获得。随后对患者家属11、12号外显子测序分析，发现该家属均携带同样的杂合突变。其中12号27752位点正向为双峰，反向则由G突变为A，由于该位点位于12内含子14位，因此不会影响氨基酸的变化，目前还不确定是否为致病突变。11号外显子共计发现5个位点突变(表1)，其中两个位点碱基的变化未影响氨基酸的变化为同义突变，三个位点碱基变化导致了错义突变。

　　三、讨论

　　引起ADPKD的三种基因：PKD1、PKD2、PKD3，其中约85%的患者为PKD1突变，15%为PKD2突变。PKD1定位于16p13.3，长度53 kb，由46个外显子组成，结构复杂且GC含量高。PKD1基因3′端的35～46外显子为单拷贝区，5′端的表1　PKD各外显子突变情况基因,外显子,突变位点,碱基,氨基酸变化,　　　　　　　突变类型PKD2,4,35689,C(T)杂合,CGA-TGA 精氨酸-终止密码子,无义突变,12,27752,G(A)杂合,位点位于12内含子区域，不影响氨基酸变化PKD1,11,26310,C(G)杂合,CTC-CTG 亮氨酸-亮氨酸,同义突变,,26411,T(C)杂合,TTG-TCG 亮氨酸-丝氨酸,错义突变,,26438,A(G)杂合,AAC-AGC 天冬酰胺-丝氨酸,错义突变,,26495,T(C)杂合,GTC-GCC 缬氨酸-丙氨酸,错义突变,,26547,C(T)杂合,AAC-AAT 天冬酰胺-天冬酰胺,同义突变

　　1～34外显子由于存在同源基因出现3次核苷酸重复，给基因测序和突变检测带来极大困难。较早的关于PKD1基因的突变检测率的报道为30%～36%[6-7]，近年来呈现上升趋势。Ding等[8]对中国60个家系的80例患者进行检测，检测到2个移码突变(12593delA,12470insA)和1个错义突变(11151C→T)，突变检测率为5%(3/60)，提示可能中国人ADPKD患者中由PKD1基因突变导致的比例相对较低，而欧美白人中大约85%的患者是由PKD1基因突变造成。1996年Qian等[9]提出“二次打击(two-hit)”学说，该学说认为遗传的PKD杂合子基因本身可以不引起多囊肾病，但在后天局部因素作用下，可再次发生体细胞突变，最终导致肾小管上皮细胞丧失正常功能。“二次打击”可以解释家系内ADPKD表现的多样性以及所有细胞都遗传了突变，但仅有1%～5%的肾单位变成囊肿的原因。本研究对PKD1的11～14号外显子测序分析，11号外显子总检出5个位点突变，2个同义突变和3个错义突变，患者与家属携相同的突变位点，提示家系中未出现病症的患者可能会在外界环境和自身基因共同作用下发病。

　　PKD2定位于4q21～4q23，长度68 kb，由15个外显子构成。PKD2基因为单拷贝，没有同源序列且长度较短，相对于PKD1基因易进行突变检测。多国报道PKD2基因突变散落在整个基因组中，无明显的突变热点。张殿勇等[10]利用PCR-SSCP技术检出13外显子2407位C→T，发生无义突变，4号外显子第964位C→T错义突变。本研究对7例患者PKD2的2～15号外显子测序分析，其中1例患者及其家属4号外显子35689位出现C(T)杂合突变，氨基酸由精氨酸突变为终止密码子，发生无义突变，该突变可能与疾病的发生有关。

　　PKD基因突变引发其蛋白结构和功能异常，导致信号传导异常，造成细胞的异常增殖、囊液的积聚、囊肿增大。PKD1基因突变所致疾病较PKD2突变所致疾病严重，PKD2出现症状的年龄较PKD1晚，有些PKD2患者虽然存在基因突变但也有可能终生不发病。目前，ADPKD尚无有效的治疗方法，因此多囊肾患者在病症前及产前进行分子生物学技术检测显得尤为重要。本研究对指导患者将来生育后代时行孕前或产前诊断，对早期发现症状前患者等提供了实验基础。

　　(本文图片见光盘)

　　【参考文献】

　　[1]　Torres VE，Harris PC.Autosomal dominant polycystic kidney disease：the last 3 years.Kidney Int,2009,76(2)：149-168.19455193

　　[2]　Gabow PA，Johnson AM，Kaehny WD，et al.Factors affecting the progression of renal disease in autosomal-dominant polycystic kidney disease.Kidney Int,1992,41(5)：1311-1319.1614046

　　[3]　Demetriou K，Tziakouri C，Anninou K，et al.Autosomal dominant polycystic kidney disease-type 2.Ultrasound，genetic and clinical correlations.Nephrol Dial Transplant,2000,15(2)：205-211.10648666

　　[4]　张维莉，梅长林.上海市汉族常染色体显性多囊肾病遗传异质性和表型差异的研究.中华医学杂志，2006,86(22)：1516-1521.

　　[5]　张殿勇，梅长林，汤兵，等.2型常染色体显性遗传性多囊肾病致病基因突变研究.中华肾脏病杂志，2004,20(1)：33-36.

　　[6]　Thomas R， McConnell R， Whittacker J， et al.Identification of mutations in the repeated part of the autosomal dominant polycystic kidney disease type 1 gene，PKD1，by long-range PCR.Am J Hum Genet,1999,65(1)：39-49.10364515

　　[7]　Perrichot R， Mercier B， Ouere I， et al.Novel mutations in the duplicated region of the PKD1 gene.Eur J Hum Genet,2000,8(5)：353-359.10854095

　　[8]　Ding L，Zhang S，Qiu W，et al.Novel mutations of PKD1 gene in Chinese patients with autosomal dominant polycystic kidney disease.Nephrol Dial Transplant,2002,17(1)：75-80.11773467

　　[9]　Qian F，Germino GG.“Mistakes happen”：somatic mutation and disease.Am J Hum Genet,1997,61(5)：1000-1005.9345111

　　[10]　张殿勇，张树忠，汤兵，等.利用PCR-SSCP技术检测中国汉族人PKD2基因的突变.第二军医大学学报，2002,23(4)：413-416.