寻常型银屑病皮损中肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶9及其抑制剂1的表达

作者：王万卷,陈丽,王晓鹏作者单位：(西安交通大学医学院第二附属医院：皮肤性病科；妇产科，陕西西安 710004) 【摘要】  目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)、基质金属蛋白酶9(MMP9)和基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)在寻常型银屑病发病机制中的作用及其相关性。方法 采用免疫组织化学SABC法检测40例寻常性银屑病皮损组织、20例非皮损组织以及20例正常皮肤组织中TNFα、MMP9 和TIMP1的表达分布情况。结果 TNFα、MMP9在银屑病皮损组织中阳性表达率明显高于非皮损组织和正常皮肤组织(P<0.05)；TIMP1在皮损组织中的阳性表达率与非皮损组织和正常皮肤组织中的表达差异无显著性(P>0.05)。在银屑病皮损中，TNFα与MMP9表达呈正相关(r=0.471, P<0.01)；MMP9与TIMP1表达呈负相关(r=-0.589, P<0.01)；TNFα与TIMP1表达呈负相关(r=-0.6，P<0.01)。结论 TNFα、MMP9和TIMP1可能在寻常型银屑病发病机制中起相互协同作用。

【关键词】  银屑病；肿瘤坏死因子α；基质金属蛋白酶9；基质金属蛋白酶抑制剂1

　　Expression of TNFα, MMP9 and TIMP1　in the lesions of psoriasis vulgaris

　　Wang Wanjuan, Chen Li, Wang Xiaopeng, Li Hongmin, Wang Yingjuan, Wang Xiuying

　　(Department of Dermatology; Department of Gynecology, the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)

　　ABSTRACT: Objective  To study the role of TNFα, MMP9 and TIMP1 in the lesions of psoriasis vulgaris. Methods  SABC immunohistochemical technique was used to examine the expression of TNFα, MMP9 and TIMP1 in lesional skin of 40 cases and uninvolved skin of 20 cases of psoriasis and in skin of 20 cases normal controls. Results  The expression of TNFα and MMP9 was significantly higher in the lesional skin than that in nonlesional skin and normal controls (P<0.05). TIMP1positive rate in the involved psoriatic skin was not significantly higher than that in uninvolved and normal skin (P>0.05). There was a positive correlation between the expression of TNFα and MMP9 (r=0.471, P<0.01), a negative correlation between the expression of MMP9 and TIMP1 (r=-0.589, P<0.01), and also a negative correlation between the expression of TNFα and TIMP1 (r=-0.6, P<0.01) in the skin lesions. Conclusion  Overexpression of TNFα, MMP9 and TIMP1 in psoriatic lesions may contribute to the pathogenesis of psoriasis.

　　KEY WORDS: psoriasis; tumor necrosis factorα(TNFα); matrix metalloproteinase9(MMP9); matrix metalloproteinase inhibitor1(TIMP1)

　　目前大多学者认为银屑病是一种多基因遗传背景下的免疫异常的炎症性疾病，在多基因遗传背景下，涉及到免疫、炎症、细胞增殖与凋亡、微血管异常等多方面原因，其确切发病机制尚不清楚[1]。在本研究中我们采用免疫组化技术观察肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorα, TNFα)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9, MMP9)和基质金属蛋白酶抑制剂1(matrix metalloproteinase inhibitor1, TIMP9)在银屑病皮损中的表达，进一步揭示三者在银屑病发病机制中的作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  病例来源  选本院皮肤科手术切除后经病理诊断为寻常型银屑病的石蜡包埋组织标本40例。患者临床表现典型，均为进行期，皮损范围25%-70%，年龄20-55岁，男21例，女19例，患者病程6个月-10年。部分病例选取包括皮损组织(进行期)、非皮损组织在内的标本2 块，皮损与非皮损组织来源于腰背部或四肢，二者相距＞5cm。全部银屑病患者术前至少2个月停止系统治疗，至少2周停止外用药治疗。另选20例骨科手术切除腰背部或四肢皮肤组织经病理诊断证实为正常皮肤组织的标本作为对照，均排除银屑病且无系统性疾病和其他皮肤病。共计40例皮损组织、20例非皮损组织、20例正常皮肤组织。银屑病组和正常对照组在年龄、性别等方面均无显著性差异。

　　1.2  方法  石蜡5μm厚连续切片，常规处理后，微波抗原修复，依次加入稀释的一抗(兔抗人MMP9、兔抗人TNFα、兔抗人TIMP1，工作浓度均为1∶100)、生物素标记二抗、SABC、DAB显色，苏木素复染。具体操作步骤严格按试剂盒说明进行。用已知阳性片作阳性对照，PBS代替一抗作空白对照。兔抗人MMP9，TNFα和即用型SABC免疫组化染色试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司。

　　1.3  结果判断标准  根据细胞染色强度和染色细胞所占面积两者积分之和来判断。染色强度积分为：不染色=0，轻度染色=1，中度染色=2，强染色=3；染色面积积分采用随机选取5个视野(每个视野计数100个细胞)计数阳性染色细胞所占的百分比均值：无细胞染色=0，＜25%细胞染色=1，25%-50%细胞染色=2，51%-75%细胞染色=3，＞75%细胞染色=4。两种积分之和≤2为阴性，＞2为阳性。

　　1.4  统计学处理  数据采用 SPSS10.0统计软件包中的秩和检验、χ2检验及Spearman等级相关性分析进行处理，以α＝0.05作为检验水准。

　　2  结果

　　2.1  各组MMP9表达  银屑病患者皮损组织与非皮损组织中MMP9阳性表达主要在表皮各层的角质形成细胞(keratinocyte, KC)的胞浆内和真皮乳头血管周围细胞的胞浆中，正常皮肤组织中基本无表达(图1A)。银屑病患者皮损组织中MMP9阳性表达率(60%)明显高于非皮损组织(5%)和正常皮肤组织(0%)，差异有统计学意义(P<0.05)。而银屑病患者非皮损组织与正常皮肤组织相比，差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

　　2.2  各组TIMP1表达  银屑病患者皮损组织与非皮损组织的TIMP1阳性表达主要在表皮各层的KC胞浆内和真皮乳头血管周围，正常皮肤组织中也有阳性表达(图1B)。银屑病患者皮损组织中TIMP1阳性表达率(25%)与非皮损组织(25%)和正常皮肤组织(5%)相比，差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

　   2.3  各组TNFα表达  银屑病患者皮损组织和非皮损组织中的TNFα阳性表达主要在表皮各层KC胞浆内和真皮乳头血管周围，正常皮肤组织中也有阳性表达(图1C)。银屑病患者皮损组织中TNFα阳性表达率(75%)明显高于非皮损组织(30%)和正常皮肤组织(10%)，差异有统计学意义(P<0.05)。而银屑病患者非皮损组织与正常皮肤组织相比，差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

　　2.4  银屑病患者皮损组织中MMP9、TIMP1和TNFα表达的相关性  银屑病皮损中MMP9阳性表达共24例，TNFα阳性表达共30例，TIMP1阳性表达共10例。其中MMP9与TNFα共同阳性表达22例，共同阴性表达8例，二者存在正相关(r= 0.471, P<0.01)；TNFα与TIMP1共同阳性表达3例，共同阴性表达3例，二者存在负相关(r=-0.6, P<0.01)；MMP9和TIMP1共同阳性表达1例，共同阴性表达7例，二者存在负相关(r=-0.589, P<0.01)。

　　图1  MMP9(A)、TIMP1(B)和TNFα(C)在皮损全层表皮中的阳性表达（略）

　　Fig.1 Positive expression of MMP9 (A), TIMP1 (B) and TNFα (C) in the whole lesional  epidermis (SABC ×400)

　　表1  MMP9、TIMP1和TNFa在各组织中的表达(阳性例数)（略）

　　Table 1  The expression of TNFα, MMP9 and TIMP1 in tissues in immunohistochemy (positive case)

　　3  讨论

　　MMP9为MMPs成员，是细胞外基质(extracellular matrix, ECM)和基底膜降解的主要酶类之一。ECM构成实质细胞的微环境，对其生命过程、结构和功能都产生着重要影响。IV型胶原作为ECM和基底膜带的主要结构蛋白，由于其独特的α螺旋结构，大部分酶对其无降解作用，而MMP9能作用于IV型胶原的特异位点使其降解[2]。MMP9使真表皮处基底膜破坏，抗基底细胞核抗体和抗角质层自身抗体及成纤维细胞产生的诱导介质和炎细胞就得以进入表皮，发生免疫反应及炎症反应损伤KC,刺激其产生细胞因子并加速其增殖，引起KC微环境改变，导致表皮动力学改变；同时MMP9在新生血管形成过程中参与内皮细胞降解基底膜、在细胞外基质中移行、内皮细胞管形成和分支等多个过程。血管基底膜的破坏使大量的免疫活性细胞如T细胞、外周单核细胞、肥大细胞等细胞本身或其分泌的细胞因子渗出到血管外，刺激了KC的增殖和细胞因子的分泌，反过来又促进了血管的变化，形成了一个正反馈的循环[3]。TIMP1广泛存在于组织和体液中，能被多种细胞因子诱导产生。TIMP1是MMP9活性的内源性特异性抑制因子，对无活性的MMP9酶原及激活的MMP9活性起特异的调节作用[4]。本实验结果发现MMP9在皮损部位中的表达增强，并显著高于非皮损部位及正常皮肤，这与陈晋广等[5]的研究结果相似。TIMP1在皮损和非皮损部位表达增高，而二者之间以及与正常皮肤的表达比较无显著性。这一结果显示在银屑病皮损中MMP9过度表达，而其抑制因子TIMP1的表达相对减弱，结果使MMP9与TIMP1表达失衡。推测二者比例失调是引起ECM和基底膜改变的基础，从而引起银屑病一系列病理反应。TNFα是一种促炎症细胞因子,是机体炎症反应与免疫反应应答的重要调节因子。本实验观察到在皮损部位中的TNFα表达增强，并显著高于非皮损部位及正常皮肤，非皮损部位与正常皮肤相比无显著性差异，这与文献报道结果相似[6]。提示TNFα在银屑病发病机制中起重要作用，它可诱导KC和血管内皮细胞表达细胞间黏附分子1[7]，从而提供了中性粒细胞与淋巴细胞的黏附位点,增强了中性粒细胞的趋化性，协助炎症细胞穿透血管壁，导致炎症细胞的浸润与活化；另外它可能促进KC增殖，产生典型银屑病皮损。体外研究表明[89]，TNFα通过一分子触发点转录因子(如AP1或NFkB)的形成而诱导MMP9表达。已经证实,MMP9的基因启动子位置存在NFkB、AP1、SP1等多种核因子结合位点,促炎细胞因子可以通过这些位点上调MMP9的表达。有研究结果显示，TNFα除可上调MMP9酶原含量外，尚可促使其向有活性的酶转化[10]。MMP9由酶原形式酶解激活的过程相当复杂,MMPs家族其他成员也常参与,而这些成员的诱导表达也受到炎症细胞因子的调节[11]。TIMP1调控主要受细胞内外激素、信息分子、效应分子及细胞内激酶等多种因素所影响。本实验结果发现TNFα表达与MMP9表达呈正相关，而与TIMP1表达呈负相关，表明TNFα与MMP9和TIMP1之间存在直接或间接的调控关系。TNFα诱导炎症细胞的浸润和活化，MMP9和TIMP1则为细胞迁移创造了条件。由此提示三者在银屑病皮损的炎症细胞浸润、KC过度增生和新生血管形成中发挥协同作用，它们构成细胞因子基质金属蛋白酶细胞间基质炎症反应之间的网络，与银屑病的发病密切相关。

【参考文献】   　[1]郑焱, 彭振辉, 谭升顺,等. 表皮中HBEGFmRNA的表达与银屑病发病的关系 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2002, 23(6):564566.

　　[2]Redondo P, Lloret P, Idoate M, et al. Expression and serum levels of MMP2 and MMP9 during human melanoma progression [J]. Clin Exp Dermatol, 2005, 30(5):541545.

　　[3]Lambert V, Wielockx B, Munaut C, et al. MMP2 and MMP9 synergize in promoting choroidal neovascularization [J]. FASEB J, 2003, 17(15):22902292.

　　[4]Roeb E, Behrmann I, Grtzinger J, et al. An MMP9 mutant without gelatinolytic activity as a novel TIMP1antagonist [J]. FASEB J, 2000, 14(12):16711673.

　　[5]陈晋广,任小丽,胡雅玉,等. 银屑病皮损中MMP2,MMP9的检测 [J]. 中国皮肤性病学杂志, 2005,19 (4):201202.

　　[6]冯信忠, 陆毅, Corrine L, et al. 细胞因子在银屑病非皮损成纤维细胞中的表达 [J].中华皮肤科杂志, 2003, 36(3):133135.

　　[7]Krunkosky TM, Fischer BM, Martin LD, et al. Effects of TNFalpha on expression of ICAM1 in human airway epithelial cells in vitro. Signaling pathways controlling surface and gene expression [J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2000, 22(6):685692.

　　[8]Stuelten CH, DaCosta Byfield S, Arany PR, et al. Breast cancer cells induce stromal fibroblasts to express MMP9 via secretion of TNFalpha and TGFbeta [J]. J Cell Sci, 2005, 18(10):21432153.

　[9]Hozumi A, Nishimura Y, Nishiuma T, et al. Induction of MMP9 in normal human bronchial epithelial cells by TNFalpha via NFkappa Bmediated pathway [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2001, 281(6):14441452.

　　[10]Han YP, Tuan TL, Hughes M, et al. Transforming growth factorbeta and tumor necrosis factoralpha mediated induction and proteolytic activation of MMP9 in human skin [J]. J Biol Chem, 2001, 276(25):2234122350.

　　[11]Nyberg P, Moilanen M, Paju A, et al. MMP9 activation by tumor trypsin2 enhances in vivo invasion of human togue carcinoma cells [J]. J Dent Res, 2002, 81(12):831835.