人乳头瘤病毒6b L1 VLPs免疫治疗生殖道尖锐湿疣的初步研究

作者：张丽芳作者单位：温州医学院 微生物学和免疫学教研室，浙江 温州 325035

【摘要】  目的:研究人乳头瘤病毒（HPV）6b型 L1蛋白形成的病毒样颗粒(VLPs)对女性生殖道复发性尖锐湿疣（CA）的免疫治疗作用。方法:采用HPV6b L1 VLPs 1μg、5μg、10μg 3组剂量经0 w、4 w、8 w免疫18例CA复发患者。分别用ELISA法和迟发性超敏反应 (DTH) 检测血清特异性抗体和细胞免疫效应，同时每周随访观察CA病变情况直到20 w。结果:所有研究对象均能在免疫后的血清中检测到特异性抗体。各剂量组免疫前后比较，血清抗体均值间差异均有统计学意义(均P<0.05)；所有患者DTH试验均呈阳性反应。经免疫治疗后20 w的观察，77.8%（14/18）的患者CA完全消退，61.1%(11/18)的患者CA于9 w之内完全消退，14例CA完全消退对象随访1年未见复发。生殖道CA消退与机体DTH反应有相关性（rs=-0.746，P=0.000）。结论:HPV6b L1 VLPs 可用于生殖道复发性CA的免疫治疗研究。

【关键词】  人乳头瘤病毒 病毒样颗粒 尖锐湿疣 免疫

    Preliminary study of HPV6b L1 virus-like particles as immune therapy for recurrent condyloma acuminatum  ZHANG Li-fang*，ZHOU Jian，CHEN Shao，et al. * Department of Microbiology & Immunology, Wenzhou Medical College ,Wenzhou  325035           

    Abstract:  Objective: To study the immune therapy of HPV6b virus like particles (VLPs) for female recurrent condyloma acuminatum(CA). Methods: Eighteen studied subjects of recurrent CA were divided into three groups, to whom 1, 5, 10 μg doses of HPV6b L1 VLPs were respectively given at weeks 0, 4, and 8. The serum specific antibody (Ab) to HPV6b L1 VLPs in different therapeutic stages was detected with ELISA, and the specific cellular immunity was detected with DTH test for all subjects. All subjects were followed up once a week till the 20th week. Results: The specific serum antibody was produced in all subjects after immunization. There was a significant difference of serum Ab mean value between pre-immunization and post-immunization in three doses groups after immunization(P<0.05); The DTH developed in all subjects. Complete regression of CA was observed in 77.8%（14/18）subjects over 20 weeks’ observation period, and the 14 subjects didn't recurrent during one year after their CA regressed. The regression of CA was related to DTH development（rs=-0.746, P=0.000）. Conclusion: HPV6b L1 VLPs can be used as immunotherapy for recurrent condyloma acuminatum.

    Key words:  human papillomavirus;virus like particle;condyloma acuminatum;immunization

    尖锐湿疣(condyloma acuminatum，CA)主要由人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）6、11型经性传播感染引起。近年来，我国CA发病呈持续上升趋势，经电灼、激光、手术等现有的方法治疗后又易复发，因而疫苗研究是防治HPV感染及其相关肿瘤的重要途径。HPV结构蛋白L1基因在杆状病毒-昆虫细胞系统中可自行组装成病毒样颗粒(virus like particles，VLPs)，这种不含病毒DNA的空衣壳具有较高的免疫原性及安全性[1，2]，为HPV基因工程疫苗的研究奠定了基础。目前，预防宫颈癌的HPV16 L1 VLPs疫苗已进入了Ⅲ期临床研究[3]，但HPV L1 VLPs对HPV相关肿瘤（CA或宫颈癌）的治疗作用少见报道。本研究对女性复发性CA用HPV6b L1 VLPs进行免疫治疗，并对生殖道CA的消退与免疫剂量、机体免疫后产生的特异性血清抗体和迟发型超敏反应（DTH）的相关性进行了分析。

    1  对象和方法

    1.1  对象  选择温州医学院第二附属医院妇产科门诊就诊的女性生殖道CA自愿者36例，可进行统计资料分析的18例，年龄18～43岁，均为经电灼或激光等治疗后复发的患者，CA复发平均时间为治疗后2 w至3个月，湿疣部位为外阴、阴道，部分患者伴有宫颈湿疣。所有患者均经病理学确诊，并经PCR方法检测为HPV6 DNA阳性，同时对任何生物制品或药物均无过敏史，且在接受治疗前3个月无全身免疫抑制剂或免疫活性药物和皮质类固醇药物使用史。

    1.2  方法

    1.2.1  HPV6b L1 VLPs：由澳大利亚昆士兰大学癌症与免疫研究中心（CICR）制备。即HPV 6b L1重组杆状病毒感染Sf-9昆虫细胞，72 h后表达的L1蛋白经离心、纯化后进行SDS-PAGE电泳、Western blot检测和电镜观察，并经无菌、热源、毒力和过敏试验等检测合格者。

    1.2.2  免疫：1μg VLPs用生理盐水稀释10倍后取0.1 ml常规皮试，阴性对象随机按免疫剂量分1μg、5μg、10μg 3个组，每组分别为5人、6人、7人。采用三角肌肌肉注射的方法，每4周1次，共免疫3次，即在0 w、4 w、8 w免疫。每周复查CA变化情况一次，观察至20 w，并随访1年。在免疫治疗前及每次免疫注射后的2 w，即0 w、2 w、6 w和10 w分别取外周血5 ml，分离血清，于-70℃保存备用。

    1.2.3  抗体检测：用ELISA方法检测血清中的IgG抗体。具体操作参见文献[4]。

    1.2.4  DTH试验：在免疫后第9～第12 w，前臂掌侧皮内注射20 ul（10μg）VLPs，48 h后观察。硬结直径大于或等于3 mm者为阳性结果（+），3～10 mm者为(++)，大于或等于10 mm者为（+++）。

    1.3  统计学处理方法  所有数据采用SPSS11.5统计软件处理。剂量和DTH反应等分类资料关联分析采用spearman相关分析，多组血清抗体均值等剂量数据经方差分析后进行LSD分析。

    2  结果

    2.1  HPV6b L1 VLPs的鉴定  HPV6b L1 VLPs经离心纯化后进行SDS-PAGE电泳、Western blot检测和电镜观察，证实为HPV6b L1 VLPS。见图1～图3。

    2.2  血清特异性抗体反应  HPV6b L1 VLPs经肌肉注射可诱导机体产生特异性的血清抗体反应。3个剂量组免疫前后的抗体均值见表1。

    2.3  DTH检测结果  经HPV6b L1 VLPs免疫后9～12 w，3个剂量组免疫对象均可产生特异性的DTH反应。其中5μg和10μg组分别有1例和3例DTH反应为（+），余均为（++）或（+++）；CA完全消退的14例中DTH反应均为（++）或（+++）；而CA仅减少或无变化的4例中，除1例DTH为（++）外，余3例均为（+）。

    2.4  临床观察结果  经HPV6b L1 VLPs免疫后CA完全消退的时间：1μg组分别为第2、第4、第5、第6、第8 w；5μg组分别为第6、第9、12 w，至第20 w时，1例CA明显减少；10μg组分别为第8、第9、第12 w，余4例观察至第20 w时，1例完全消退，1例明显减少，2例没有消退。观察至20 w，77.8%（14/18）的患者CA完全消退，其中61.1%(11/18)的患者CA于9 w之内完全消退，其外阴、阴道部位的CA消退后不留任何痕迹；11.1%（2/18）的患者CA明显减少；11.1%（2/18）的患者CA没有变化。对14例CA完全消退对象在CA消退后随访1年，无复发。

    2.5  CA消退与免疫剂量、DTH反应和血清抗体间的关系  将CA未完全消退（包括明显减少）或无消退的归为未消退组，与完全消退组间的免疫剂量、机体的DTH反应及血清特异性抗体的均值间的关系见表2。CA消退与与机体DTH反应有相关性（rs=-0.746，P=0.000），与免疫剂量无相关性（rs=0.424，P=0.075），与机体在免疫前后（0、2、6、10 w）的血清特异性抗体的均值均无相关性（rs=-0.387，P=0.112；rs= -0.115，P=0.540；rs=0.103，P=0.684；rs=0.155，P=0.540）。

    3  讨论

    HPV L1 VLPs主要用于预防HPV感染及其相关肿瘤的疫苗研究，Yan等[5]报道HPV L1 VLPs能被在体外被树突状细胞和朗格汉斯等APC细胞摄取，并将源自VLPs的抗原肽经MHC-Ⅰ类途径提呈给特异性T细胞，从而激发特异性的CTL反应。目前，已经进行的HPV L1 VLPsⅠ期临床试验均在健康志愿者中进行，结果表明HPV11、HPV16、HPV18型的 L1 VLPs均可诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫[6～8]；Christensen等[9]在棉尾兔模型研究中证实，1μg兔乳头瘤病毒(CRPV) L1 VLPs能保护棉尾兔免受CRPV感染，其保护力可维持一年。上述体内外试验结果均表明，由HPV L1构成的VLPs能诱导机体产生足够强的特异性细胞免疫，可达到清除病毒，预防和治疗HPV感染及其相关肿瘤的目的。

    由于DTH反应检测操作简便，易于观察，故本研究选择DTH反应作为机体免疫治疗后产生细胞免疫反应的一种检测指标。结果发现，在1μg剂量组中机体产生特异性DTH反应较为剧烈，均为（+++）, 临床观察该组CA消退时间较快，平均6 w；同时在5μg、10μg两组的观察中，发现CA未消退或消退不理想者，其DTH反应均比较低，为（+）或（++）。经CA消退与DTH反应的相关性分析，表明CA消退与机体产生的特异性DTH反应与有关，提示细胞免疫在机体发挥免疫保护和消除细胞内HPV感染的免疫反应中起主要作用。

    Evans等[8]设计了3μg、9μg、30μg、100μg四个剂量组，用HPVl1 L1 VLPs对健康成人经0 w、4 w、16 w的免疫，通过检测病人的血清抗体和外周血单个核细胞（PBMC）产生的IL-5以及INF-γ产生的情况，结果证明四种剂量均可产生较强的免疫反应。本研究通过2 w、6 w、10 w血清抗体反应检测，显示1μg、5μg与10μg剂量组均可产生血清特异性抗体反应，但免疫剂量及免疫前后血清特异性抗体效价与CA消退均无相关性。

    从血清特异性抗体的产生、DTH反应和CA消退等情况综合分析，本研究所设计的0 w、4 w、8 w免疫方案较为合理，经HPV6b L1 VLPs免疫20 w观察，CA完全消退率达77.8%。经免疫治疗后痊愈的14例对象，在生殖道CA消退后随访1年，均未复发，这表明，HPV6b L1 VLPs 对复发性CA可能具有较好的免疫治疗作用，其免疫保护效应至少可维持1年时间。本研究结果可为采用HPV基因工程疫苗防治HPV感染及其相关肿瘤提供理论依据，也可为选择合适的免疫剂量及免疫程序提供参考。

【参考文献】[1] Frazer IH. Prevention of cervical cancer through papillomavirus vaccination[J]. Nat Rev Immunol,2004,4(1):46-54.

[2]Zhang LF, Zhou J,Chen S, et al. HPV6b virus like particles are potent immunogens without adjuvant in man[J]. Vaccine, 2000, 18 (11-12):1051-1058.

[3]Stanley MA. Human papillomavirus vaccines[J]. Rev Med Virol,2006,16(3):139-149.

[4]张丽芳,吕杰强,陈韶,等. HPV6b L1 蛋白在昆虫细胞中的表达及其作为特异性诊断抗原的初步研究[J].温州医学院学报, 2001,31(6):341-343.

[5]Yan M, Peng J, Jabbar IA, et al. Despite differences between dendritic cells and Langerhans cells in the mechanism of papillomavirus-like particle antigen uptake, both cells cross-prime T cells[J]. Virology,2004 ,324(2):297-310.

[6]Evans TG, Bonnez W, Rose RC et al. A Phase 1 study of a recombinant viruslike particle vaccine against human papillomavirus type 11 in healthy adult volunteers[J]. J In- fect Dis,2001,183(10):1485-1493.

[7]Koutsky LA ,Ault KA ,Wheeler CM ,et al. A controlled trial of a human papillomavirus type 16 vaccine[J]. N Engl J Med, 2002,347(21) :1645-1651.

[8]Ault KA, Giuliano AR, Edwards RP ,et al. A phase I study to evaluate a human papillomavirus (HPV) type 18 L1 VLP vaccine[J]. Vaccine, 2004 ,22(23-24):3004-3007.

[9]Christensen ND, Reed CA, Cladel NM, et al. Immunization with viruslike particles induces long-term protection of rab-bits against challenge with cottonail rabbit papillomavirus[J]. J Virol, 1996,70(2):960-965.