组织工程化皮肤及其临床应用进展

作者：荣祥明作者单位：第四军医大学唐都医院皮肤科， 陕西 西安 710038

    【摘要】  组织工程皮肤是通过在体外培养扩增大量的功能细胞,复合到支架材料,通过细胞与支架的相互作用,诱导、生长形成三维的有活性的皮肤替代物。组织工程化皮肤的发展为皮肤移植治疗创伤引起的皮肤缺损及皮肤疾病提供了新的发展方向,组织工程化皮肤在一定程度上克服了原有的皮肤供区不足、免疫排斥、传播疾病等各种问题，具有远大的开发前景。作者综合分析组织工程皮肤的研究及临床应用，并对其未来进行展望。

     【关键词】  组织工程皮肤 治疗 创伤 皮肤病

    皮肤是人体与外界环境接触的屏障,不仅起保护、分泌、代谢和感觉等作用,而且参与免疫反应和维持机体内环境的稳定。但严重创伤和大面积烧伤患者的皮源缺乏一直是临床亟待解决的难题。随着组织工程学的建立和形成，组织工程化皮肤的研究已成为生命科学研究领域的热点之一，已走在该领域的前列，并成为其他组织和器官重建的一个范例。而组织工程皮肤产品开发的成功，使人工皮肤的研究实现了质的飞跃。自从Rheinwald［1］成功建立表皮细胞培养方法以来，随着组织工程技术及工艺技术的提高，各种组织工程皮肤相继问世及应用于临床，目前比较成熟的产品主要有:Apligraf、Alloderm、Integra、Dermagraft和ActivSkin 等。根据组织工程皮肤的结构不同,可将其分为表皮替代物、真皮替代物和全皮替代物。现依据近几年来的相关文献，就组织工程化皮肤及临床应用作一综述，并对其未来研究进行展望。

    1  组织工程化皮肤

    1.1  表皮替代物  1975年Rheinwald等［1］利用照射处理过的3T3成纤维细胞作为滋养层,培养人表皮细胞获得成功。1981年O′Conner［2］首次应用此方法在体外培养出适于移植的自体表皮细胞膜片,经长时间临床观察，发现表皮细胞膜片脆性大,移植成功率低，而且抗感染能力差,移植后表皮不耐磨擦,容易出现水疱、易收缩,培养表皮自体移植物由于缺少真皮成分致使移植后表皮易结痂收缩，与创面结合不稳固。人们意识到需在膜片下增加支持物，可以解决临床上一定厚度、柔韧性和可操作性的要求。Horch等［3］将角质化细胞接种在胶原膜上，几天后细胞融合成单层即进行移植，与常规做法相反，表皮细胞转向创面，表面胶原膜，角质化细胞在移植区内继续增殖，缩短了创面愈合周期，也减少了角质化细胞的体外培养时间。

    1.2  真皮替代物  真皮替代物的研制是在表皮替代物的研制与临床应用的基础上发展起来的,在皮肤移植中，真皮成分是很重要的。真皮可增加创面愈合后的皮肤弹性、柔软性及机械耐磨性,减少瘢痕增生。真皮替代物可基本分为2大类，即天然真皮与人工合成真皮。

    天然真皮替代物应用最多的是脱细胞真皮。脱细胞真皮是将经酶消化、高渗盐浸泡处理的异体(种)皮,去除表皮层和真皮内的细胞成分,保留完整的胶原纤维及基底膜等细胞外间质成分，其主要成分包括胶原、弹性蛋白、蛋白多糖等不溶性基质成分。脱细胞真皮具有低抗原性、诱导成纤维细胞长入、引导表皮细胞生长,不容易被降解,抗感染能力强的特性。代表产品有美国Lifecell开发的Alloderm。

    人工合成真皮主要采用胶原GAG（氨基葡聚糖，主要成分为6硫酸软骨酸）、胶原凝胶、聚羟基乙酸（polyglycolic acid ，PGA）/聚乳酸(polylactic acid,PLA）网、尼龙网作为真皮支架，结合成纤维细胞、表皮细胞培养成皮肤替代物。1991年Copper等［4］在PGA 2种可吸收缝线制成的网架上接种从新生儿包皮中获取的成纤维细胞,成纤维细胞增殖并分泌多种基质蛋白,如胶原纤维连接蛋白、细胞外基质等，形成由成纤维细胞,细胞外基质和可降解材料构成的人工真皮(dermagrft)。Chen等［5］用PLA/PGA共聚物和胶原材料制成的混合网架,接种上成纤维细胞,再将其植入裸鼠背后,2周后形成真皮组织,成纤维细胞的接种效率、分布和生长状态要明显优于单纯的PLA/PGA共聚物材料。

    真皮替代物的研制在某些方面弥补了表皮替代物的缺点,有较好的应用前景,但同时它也存在某些方面的不足,如易导致水分丢失,移植后还要再进行二次表皮移植。

    1.3  复合皮肤替代物  复合皮肤替代物就是指表皮与真皮替代物构建的接近正常皮肤结构的一种皮肤替代物。构建完整的皮肤不仅可恢复皮肤的功能和外观,而且表皮和真皮基质成分相互影响的机制，促进彼此的分化,促进创面愈合。1981年Bell等［6］将表皮膜片与新生儿包皮细胞和真皮成纤维细胞在凝胶中生长形成的真皮相结合形成复合皮移植并获得成功。1997年经FDA批准上市的Apligraf是目前最成熟的既含有表皮层又含有真皮层的组织工程复合皮，其细胞成分均来源于新生儿包皮。采用异体成纤维细胞接种于牛胶原凝胶中形成细胞胶原凝胶,1周后接种角质形成细胞,浸没培养4 d,角质化细胞融合成片,然后进行气液界面培养1～2周,即为产品Apligraf。国内金岩等［7］用免疫原性较低的胎儿皮肤作为细胞来源,牛Ⅰ型胶原为支架构建成人组织工程ActivSkin,其具有较薄的表皮层和较厚的真皮层，是一种良好的生物活性皮肤替代物，可用来修复全层皮肤缺损。目前,组织工程复合皮肤作为一种新型的创面覆盖物,在创造良好的愈合环境,缩短创面愈合时间上已被广泛认可。

    2  组织工程化皮肤的临床应用

    2.1  烧伤  早期的烧伤创面覆盖可以限制细菌生长，预防感染，防止水分及电解质的丢失，自体皮肤移植是治疗烧伤的首选，但是对于大面积烧伤，自体皮肤不能满足需求，异体皮肤且引起明显的免疫排斥，组织工程化皮肤无疑是较为理想的替代物。烧伤创面治疗是应用组织工程皮肤技术最早的领域,特别是Ⅱ度以上需要进行皮肤移植的烧伤病例,包括早期创面覆盖及后期瘢痕修整。Clayman等［8］把Integra (Integral Lifesciences Corporation,Plainsboro,NJ,USA)) 用于烧伤后引起的增生性瘢痕重建,术中将瘢痕组织全部切除达一定深度,以保证移植物植入到无瘢痕且血运丰富的血管床区,术后其功能恢复良好。刘亚玲等［9］用组织工程ActivSkin（艾尔肤公司,陕西)对31例深度烧伤创面进行修复。结果显示深II度创面25例,愈合时间比对照组提前6 d(P<0.05)，III度创面6例,愈合时间比对照组提前20 d(P<0.05)。Lida等［10］以口腔黏膜角质化细胞为种子细胞，以同种脱细胞真皮为支架进行体外培养构建的组织工程化皮肤治疗大面积烧伤，也取得满意疗效。

    2.2  慢性皮肤溃疡  慢性皮肤溃疡(chronic skin ulcer,CSU)又称难治性溃疡，临床上慢性皮肤溃疡包括糖尿病的溃疡、静脉性难治性溃疡、受压所致的溃疡以及一些其他疾病导致的溃疡等，目前对慢性皮肤溃疡的发病机制还不是很清楚， 多数学者认为其与外周动脉疾病、外周神经疾病、骨质异常、与伤口愈合相关的蛋白质、内皮细胞机能紊乱、微循环障碍等因素有关。 在治疗上也缺乏有效的方法,应用组织工程皮肤治疗多能取得较好疗效。Omar等［11］用Dermagraft治疗静脉性溃疡，创面12周内愈合率和对照组比较为50%12.5%，创面缩小比较为84%16%。聂鑫等［12］用组织工程ActivSkin修复19例慢性皮肤溃疡,与对照组相比应用后创面明显缩小，试验组的平均愈合时间24.37 d，明显少于对照组（64.05 d），在使用ActivSkin过程中患者皮肤未发现排斥反应，也未发现溃疡复发的病例。张兆清等［13］利用组织工程学方法,以牛胶原为支架,自体骨髓间充质干细胞作为种子细胞构建成组织工程化复合皮肤，对1例双下肢溃疡15 a的患者进行移植,4周后溃疡面积缩小40%,9周后溃疡面积缩小90%。构建的复合骨髓间充质干细胞的组织工程真皮移植后,提高了愈合速度,获得了较理想的创面愈合效果，为临床治疗类似溃疡型疾病提供了新的治疗思路。

    2.3  营养不良型大疱性表皮松解症  营养不良型大疱性表皮松解症（dystrophic epidermolysis bullosa）是常染色体遗传性皮肤病,以皮肤黏膜脆性增加,容易出现水疱和血疱,愈后留有萎缩性瘢痕为特征，对于营养不良型大疱性表皮松解症患者尚无特效的治疗方法,主要采取对症及支持治疗，加强营养,纠正贫血,注意减少碰撞与摩擦,加强病损区的保护。Fivenson等［14］报道,用Apligraf治疗5例患有营养不良型大疱性表皮松解症的儿童,5～7 d后观察,治疗部位90%～100%治愈,10～14 d后,许多治愈部位接近正常皮肤，手部及掌部皮损得到80%～90%改善。Dagregorio等［15］成功地用Integra为1例合并鳞状上皮细胞癌的隐性遗传营养不良型大疱性表皮松解症患者进行移植，手术7周后移植物全部成活。

    2.4  白癜风  白癜风（vitiligo）是一种由于黑素细胞破坏而致皮肤黑色素减少为特征的获得性皮肤病。本病原因不明，与遗传、免疫、精神等因素有关，发病机制可能是损伤局部表皮真皮交界处黑色素细胞酪氨酸酶功能丧失，使酪氨酸氧化为多巴受阻，从而使黑素的形成发生障碍［16］。药物治疗效果不明显，手术治疗以自体表皮移植为主，采用自体（同种异体）黑色素细胞移植已成为研究治疗白癜风的热点。vanGee等［17］用体外培养的自体黑素细胞和角质化细胞的透明质酸混悬液撒播在已被激光处理过的白斑病损区，3周后数字成像系统显示62%的患者移植区恢复了颜色。Pianigiani等［18］从自体正常皮肤取一小块活体表皮在用患者血清作为基质的透明质酸生物膜上进行表皮细胞培养构建表皮膜片，移植于经窄谱中波紫外线照射3周后的病损区，经18个月的随访，结果发现75%的局部和节段型、30%泛发型患者恢复着色。卢涛等［19］从自体表皮培养出黑素细胞悬液，移植到10例患者的白斑区，3个月后6例在治疗点较周围白斑加深，2例色素沉着较明显，并略发红，接近周围正常肤色，同种异体黑素细胞移植治疗白癜风实践还不够，需进一步观察，并作大量的研究。

    2.5  光化性紫癜  光化性紫癜（actinic purpura）又叫老年型紫癜,是一种老年性退行性变化的皮肤病。由于衰老,皮肤变薄松弛,皮肤和皮下组织萎缩,缺少弹性,小血管周围的支持性胶原组织变性而失去支持,轻微外伤可发生表皮裂口,表皮和真皮间血管容易破裂出血,产生紫癜。本病应避免外伤防止新损伤，常规给于维生素、同化激素，部分病人应用有效。Banta 等［20］对1例老年男性光化性紫癜志愿者前臂薄层去皮,然后移植Apligraf，创面愈合良好,移植部位可正常耐受牵拉,美容效果也不错。

    2.6  外伤及外科继发性难以修复的皮损  组织工程化皮肤可以治疗瘢痕、巨痣、太田痣、文身及一些肿瘤等切除后形成继发皮损。Kopp等［21］用胶原结构的替代物移植于23例头皮的黑素瘤、鳞癌、血管肉瘤、基底细胞癌及脑纺垂体瘤等手术继发性头皮缺损,患者中仅有6例患者由于头皮脓肿而延迟了创面愈合,其余患者都较快愈合。McGuigan等［22］报道，在伊拉克、阿富汗战争期间应用组织工程皮肤治疗战伤性皮肤缺损，可以预防感染和创面干燥，减少疤痕形成，缩短治愈时间，从而减轻伤员痛苦。Maier等［23］用Apligraf治疗10例外伤性撕脱伤致皮肤萎缩,所有患者均在60岁以上,且多数长期使用激素，皮肤薄而萎缩,平均治疗时间为9.2周，治愈率达100%,所有创面未出现感染。Almond等［24］把Integra 移植于巨大脐疝术后的创面也受到良好的临床效果。

    3  存在问题及展望

    组织工程化皮肤研究的最终目标是构建出功能、外形与自体皮肤相同或相似的永久性皮肤替代物。尽管目前已有许多组织工程化皮肤具有与正常皮肤相似的结构及屏障功能,应用于临床取得了一定疗效,但仍不具备完整的皮肤结构,尤其是缺乏神经、血管、毛发等附属器结构，皮肤也缺乏黑色素细胞和免疫功能。如何构建含正常附属结构的多功能皮肤替代物是国内外学者追求的目标和着力研究的热点课题。Gingras等［25］以成纤维细胞和角质化细胞为种子细胞、壳多糖胶原海绵三维结构构建的组织工程化皮肤中加入神经生长因子，然后移植于裸鼠的背部，40 d后观察到有雪旺细胞呈线性分布，60 d后发现有神经沿着雪旺细胞(Schwann cell)蔓延生长，此结果为组织工程皮肤内神经再生提供了新的前景。Tremblary等［26］把血管内皮细胞、皮肤角质化细胞和成纤维细胞混合在胶原海绵中，这种皮肤替代物自发形成具有毛细血管样的网状结构，移植于裸鼠的皮肤缺损中，4 d后就发现毛细血管样结构中含有裸鼠血，有助于组织工程皮肤的快速血管化的临床应用。Shepherd［27］认为用从胎儿脐带血中获取血管原始祖细胞分化的内皮细胞构建的皮肤替代物，可以促进有免疫缺陷的患者皮损部位血管化的形成。刘源等［28］以包皮为细胞来源,采用消化法获得角质化细胞、成纤维细胞和黑素细胞,在自行设计的组织工程皮肤培养系统构建组织工程皮肤，经Dopa染色和S100免疫组织化学结果显示,在组织工程皮肤基底层处可见散在分布处于良好状态的黑色素细胞,这种含有黑素细胞的组织工程皮肤可用于下一步的动物实验和临床实验。麦跃等［29］研究发现毛囊细胞比真皮成细胞和表皮角质化细胞有更强的增殖分化能力和更多的生物学特性，在构建带有皮肤附属器的组是工程化皮肤上有潜在的前景。作者相信，随着相关学科的发展和技术的进步，功能与外形满意的永久性组织工程化皮肤在不久的将来一定会变为现实。

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