解脲脲原体检测方法研究进展

作者：任秀柳    作者单位：吉林医药学院

【摘要】  解脲脲原体（Uu）是引起性传播疾病的病原体之一，在非淋菌性尿道炎中，是除衣原体外第二位病原体。Uu除可通过两性接触传播，还可经胎盘传播，引起流产、死胎、先天缺陷，并与不孕症有关。因此及时准确的病原学检测对临床诊治具有十分重要意义。目前检测Uu的方法较多，本文就此作一简要综述。

【关键词】  解脲脲原体 性传播疾病 病原学检测

    解脲脲原体（ureaplasma urealyticum，Uu）也称为溶脲脲原体，属于柔膜体纲、支原体目、支原体科、脲原体属。脲原体属有两个种，其中与人类疾病关系密切的只有Uu，主要引起人类泌尿生殖道的感染。Uu是人体泌尿生殖道常见的寄生菌之一，在特定条件下引起非淋菌性尿道炎（nongoncoccal urithritis，NGU），目前感染者日益增多［1］。Uu在人体定植数量有两次高峰期，即分娩时由母体产道感染新生儿，以后迅速减少，从性生活开始又逐渐增多。Uu大小一般为50～300 nm，结构简单，无细胞壁，其形状呈高度多态性。营养要求高，生长缓慢。耐酸，最适pH值为6.0。固体培养基上形成的菌落微小，只有数十微米，因此又曾将Uu称之为“T株”（tiny strain）。Uu的致病机制尚不十分清楚，认为可能与其侵袭性酶和毒性产物有关，其中神经氨酸酶样物质可干扰精子和卵子结合，可能与不孕症有关。目前病原学检查方法主要有分离培养及分子生物学检测，也有人以Uu培养物为抗原，采用酶联免疫吸附技术检测患者血清抗体。不同方法各有其特点，寻求快速、简便、准确检测Uu的方法对于临床诊治十分必要［2］。

    1  培养法

    培养检测Uu是传统的病原学检测方法，也是确定Uu感染的金标准。培养法分为液体培养和固体培养两步完成。

    1.1  液体培养

    Uu常用的液体培养基是以牛心浸液为基础，另加一定量的小牛血清、新鲜酵母浸液、蛋白胨、氯化钠、尿素、指示剂（多为酚红）、抑菌剂（多为青霉素类抗生素）等，调pH至6.0。液体培养基为Uu的生长培养基。将采集到的拭子标本立即置于生理盐水或PPLO基础培养液中洗涤，用0.2～0.45 μm的滤器过滤（滤菌），取1/10体积过滤液加至Uu液体培养基中。置37℃恒温培养，在48 h内不断观察颜色变化状况［3］。

    近年来，一些医疗机构和厂商利用Uu分解尿素产生碱性的NH3，能使酚红指示剂发生由黄变红的变化，直接将标本接种于液体培养基当作Uu检测技术。有研究表明，其他能分解尿素产生碱性的NH3能力的变形杆菌、新型隐球菌、铜绿假单胞菌、克雷伯氏菌、白色念珠菌等微生物均能使国产的3种Uu液体培养基出现由黄变红的变化（假阳性）。如果Uu液体培养基被标本中的产酸菌污染，Uu产生的碱性物质被中和，假阴性也随之产生了。因此液体培养不能准确判断有无支原体感染，不能做到纯分离，而且一种液体培养基不能同时判断两种以上支原体感染。

    1.2  固体培养

    固体培养基的主要成分与液体培养基相同，是Uu的鉴别培养基。液体培养基在48 h内如由黄变红，立即再次过滤，取0.2 ml 转种于Uu 选择性培养基（内含0.05%尿素及0.015%硫酸锰）。后置37℃含95%N2及10%CO环境中孵育，48 h观察菌落。当在相差显微镜下观察到棕色、15～50 μm 特征性的细小“荷包蛋”样菌落或颗粒样、桑椹样菌落为Uu阳性。

    李婷等［4］将传统的固体培养基进行改良，增加血清含量，添加细胞培养液（10%DMEM）促进支原体生长，抑菌剂除传统的青霉素外还添加了非抗生素类抑菌成分。将采集到的标本直接划线接种于固体培养基上，在CO2培养箱中培养，菌落在16～40 h间形成，初代培养即得到典型的Uu菌落。与液体培养基相比，分离阳性率无统计学差异，且污染率明显低于液体培养法。

另外有法国梅里埃生产的A7琼脂，虽然效果较好，但价格昂贵，需要提前1个月订购。

    2  分子生物学技术

    2.1  PCR技术

    培养法检测Uu虽然简单，但费时且不能区分解脲脲原体的2个生物群。随着PCR 在微生物学领域的广泛应用，许多研究人员利用解脲脲原体2个生物群的mba基因（multiple banded antigen gene）、16SrRNA基因、16S223S rRNA基因、脲酶基因等的差异，建立了常规PCR、PCR-SSCP、PCR-系统进化分析法、PCR-微孔杂交法、反向斑点杂交方法、PCR-液相杂交法等方法，对解脲脲原体2个生物群进行检测［5-9］。Teng 等［6］建产的方法仅需要1对引物，依据扩增片段长度差异，使用琼脂糖凝胶电泳来检测解脲脲原体的2个生物群。相对其他方法而言，操作简单、快速。但是解脲脲原体的2个生物群的PCR扩增产物仅有45 bp的差异，而琼脂糖凝胶电泳的分辨率不高，容易产生错误的检测结果。周世航等［10］引入高分辨率的毛细管技术（CE），建立的PCR-CE方法，能够很好的区分解脲脲原体的2个生物群，敏感性达10拷贝/50 μl，而且仅特异扩增解脲脲原体生物群1、2，而对于HBV以及尿道中常见的一些细菌、真菌等不产生扩增。覃春容等［11］首次采用反相斑点杂交对341例单纯解脲脲原体感染进行了基因型鉴定，将微小脲原体所有4个基因型明确区别开，对T960群亦能同时检测，实验灵敏度为89.1%，阳性预测值达100%。

    2.2  TDI-FP技术

    即荧光偏振与模板指导的末端延伸反应检测技术。荧光偏振检测偏振光而非荧光强度，大大增加检测灵敏度。TDI反应是在DNA模板引导下的引物末端延伸反应，通过确定探针与靶DNA的识别杂交及在特定位置特异碱基掺入决定基因型，通过引物扩增、探针杂交及杂交后特异碱基掺入三重把关，确保反应特异性［12］。王香玲等［13］采用TDI-FP技术检测与常规检测结果向对比，符合率高达100%。

    3  其它方法

    3.1  微孔渗漏法

    测定原理是标本窗的吸收垫有支原体抗原吸附其上，加入患者血清再以胶体金标记的单克隆抗支原体IgM抗体测定，三者形成免疫复合物。在结果窗中出现一个点表明试剂有效，如在相应检测位置出现圆斑表示Uu阳性。此法无需特殊设备，10 min即可报告结果。袁建芬等［14］对240例尿道、生殖道分泌物同时应用微孔渗漏法、PCR法和液体培养法进行检测。结果微孔渗漏法阳性162 例（67.5%），与液体培养法相比，二者差异无统计学意义。

    3.2  免疫组化法

    此法是用标记物标记的抗体与组织或细胞的抗原反应，结合形态学检查，对抗原进行定性、定量、定位检测的技术。李建蓉等［15］在自制Uu免疫血清的基础上，开展了用免疫组化法检测Uu抗原，并与目前常用的培养法和PCR法比较，它们之间差异无显著意义。并且该法具有简便快速（3 h左右），不需要特殊的设备，标本处理后可长期保存等优点。

    总之，目前检测Uu的方法很多，各有优缺点。各单位应结合实际情况，根据实际需要，选择相应的检测方法。

【参考文献】［1］ Takahashi S，Takeyama K，Kunishima Y，et al.Analysis of clinical manifestations of male patients with urethritis［J］.J Infect Chemother，2006，12（5）:283-286.

［2］ 李闻文，贺辉，肖建华，等.解脲脲原体四型MB抗原基因的克隆测序及其在大肠埃希菌中的表达［J］.中华检验医学杂志，2003，26（9）: 567.

［3］ 李琴，谢平，汪圣强，等.液体培养法与套式PCR法检测解脲脲原体比较研究［J］.中国优生与遗传杂志，2000，8（5）：33-35.

［4］ 李婷，叶元康.固体培养基直接分离解脲脲原体和人型支原体方法的研究［J］.中华检验医学杂志，2005，28（10）：1081.

［5］ Teng L J，Zheng X，Glass J I，et al.Ureaplasma urealyticum biovar specificity and diversity are encoded in multiple-banded antigen gene［J］.J Clin Microbiol，1994，32（6）:1464-1469.

［6］ Pitcher D，Sillis M，Robertson J A.Simple method for determining biovar and serovar types of Ureaplasma urealyticum clinical isolates using PCR-single-strand conformation polymorphism analysis［J］.J Clin Microbiol，2001，39（5）:1840-1844.

［7］ Yoshida T，Maeda S，Deguchi T，et al.Phylogeny-based rapid identification of mycoplasmas and ureaplasmas from urethritis patients［J］.J Clin Microbiol，2002，40（1）:105-110.

［8］ Yoshida T，Maeda S，Deguchi T，et al.Rapid detection of Mycoplasma genitalium，Mycoplasma hominis，Ureaplasma parvum，and Ureaplasma urealyticum organisms in genitourinary samples by PCR-microtiter plate hybridization assay［J］.J Clin Microbiol，2003，41（5）:1850-1855.

［9］ Wang H，Kong F，Jelfs P，et al.Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic Mollicutes strains by reverse line blot hybridization［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70（3）:1483-1486.

［10］ 周世航，张卓然.解脲脲原体生物群聚合酶链反应-毛细管电泳检测方法的建立及应用［J］.微生物与感染，2007，2（1）:39-43.

［11］ 覃春容，姚吉龙，张帝开，等.反相斑点杂交快速诊断解脲脲原体基因型及其临床意义［J］.中国妇幼保健，2007，22（3）：382-385.

［12］ Hsu T M，Chen X，Duan S，et al.Universal SNP genotyping assay with fluorescence polarization detection［J］.Biotechniques，2001，31（5）:560-568.

［13］ 王香玲，张菊，王小利，等.荧光偏振技术同步检测沙眼衣原体解脲脲原体方法的研究［J］.中华检验医学杂志，2005，28（03）：329.

［14］ 袁建芬，喻海忠.微孔渗漏法与聚合酶链反应联合检测解脲脲原体［J］.南通大学学报：医学版，2005，25（6）：438-439.

［15］ 李建蓉，公瑞煜，王晶.免疫组化法检测解脲脲原体的研究.中国优生与遗传杂志，2003，11（1）：45.