RNA干扰沉默食管癌细胞株ECA109中人乳头瘤病毒18型E6、E7基因对人类白细胞抗原Ⅱ类分子表达的影响

RNA干扰(RNAi)是近年发展起来的一项基因调控新技术,其作用原理属于转录后基因沉默机制,能特异而高效地沉默靶基因的表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,费立聪等已成功利用反义RNA抑制食管癌细胞的生长.本课题组前期研究中已成功合成并鉴定人乳头瘤病毒18型(HPV18)E6,E7基因的短发夹RNA(shRNA)重组腺病毒载体(shpAd-E6-eGFP,shp.Ad-E7-eGFP),我们将2条载体转染HPV18阳性食管癌ECA109细胞株,观察其对ECA109细胞中E6,E7基因及人类白细胞抗原(HLA)一11类分子表达的影目.　　材料与方法　　1.材料:食管癌细胞株ECA109购自中国科学院上海细胞库;含有E6,E7基因片段的shRNA腺病毒载体(shpAd-E6-eGFP,shpAd-E7-eGFP)由本课题组前期构建;DMEM培养液、胎牛血清(FBS)均购自美国Gibe.公司;RNA提取试剂盒购自Omega公司;逆转录试剂盒及实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)试剂盒均购自Fermentas公司;抗HPV18-E6/E7单克隆抗体、抗人类白细胞抗原DR基因(HLA-DR)/DP/DQ单克隆抗体购自美国SantaCruz公司.　　2细胞培养:DMEM培养液中含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100m彭L,于370C,S}lcCOZ的饱和湿度培养箱内培养.用0.25%胰酶消化传代.　　3.细胞转染:将包装好的含有E6,E7基因片段的腺病毒载体(shpAd-E6-eGFP,shpAd-E7-eGFP和无关序列)感染食管癌细胞株,每组样品各重复感染3次.　　将磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤过的食管癌细胞,加人转染复数(MOI)-10的重组腺病毒,37℃培养1h,期间每隔15min左右轻轻晃动培养瓶,1h后吸去病毒液加人PBS洗涤,以5%血清的病毒维持液培养.　　4.实验分组:实验分3组:细胞生长液阴性对照组(空自对照组);无关序列siRNA对照组(无关序列组八转染HPVI8E6,E7shRNA实验组(siRNA实验组).　　5.FQ-PCR检测HPV18E6,E7及HLA-IImRNA的表达:病毒载体转染ECA109细胞后48h,用RNA提取试剂盒(Omega86934/86834)提取细胞总RNA,并用紫外分光光度计Gene(}uanPr.测定其浓度,逆转录合成cDNA.然后经过DNaseI处理,加人Maxima.　　SYBRGreen/ROXqPCRMasterMix-(2x)I0},1、上游引物(10}.},mol/L)0.4N.,l、下游引物(10}.},mol/L)0.4闪、cDNA1闪、高纯度水,无核酸酶8.2闪体系,初期变性:95℃10min1个循环;变性:95℃15s50次循环,退火/延伸:61℃31s50次循环,解离:95℃15s,60℃30s,95℃15s为1次循环反应,内参选择为18S,读取循环阑值(Ct)值,首先计算各样本待测基因Ct值与内参基因(18S)Ct值的差值,即△Ct等于Ct(待测基因)减去Ct(内参),再将各实验组样本的△Ct减去正常对照(空白组)的△Ct,即得△DCt,最后利用2一△立〔进行计算.使用该方法可以直接得到待测基因相对于内参基因的表达量.　　6.Westernblot法检测HPV18E6,E7及HLA-IImRNA的表达:Westernblot对HPV18E6,E7shRNA阴性对照、无关序列组及:iRNA实验组的蛋白表达水平进行测定.细胞经过lx一十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶加样缓冲液处理,所得到的总蛋白经过12%聚丙烯酞胺凝胶电泳转移至硝酸纤维滤膜上,HPV18E6,E7和HLA-II一抗(SantaCruz公司)稀释浓度为1/500,二抗(SantaCruz公司)稀释浓度为1/10000硝酸纤维素膜上蛋白质条带用计算机采集图像并进行灰度分析7.统计学方法:应用SPSS17.0统计软件分析,采用独立样本t检验结果1病毒载体转染食管癌ECA109细胞:病毒载体与ECA109细胞混合后,370C,5%COZ的饱和湿度培养箱内培养48h,倒置显微镜下观察,85%的细胞出现绿色荧光.　　2.FQ-PCR检测HPV18E6,E7的相对表达量:HPV18E6,E7mRNA的表达作用48h抑制效果最明显,E6siRNA组E6mRNA表达量是空白组细胞组的7.3,差异有统计学意义(P<0.01);而E6无关序列组E6mRNA表达量是空白组细胞组的98.7%,差异无统计学意义(P>0.05);E7siRNA组E7mRNA表达量是空白细胞组的10.1,差异有统计学意义(P<0.O5);而E7无关序列组E7mRNA表达量是空白细胞组的99.1%,差异无统计学意义(P>0.05).以蛋白表达差异倍数做统计分析图(图1).　　3.FQ-PCR检测HI,A-II的相对表达量:转染48h后,FQ-PCR检测各组细胞中HLA-II类分子mRNA的表达,E6siRNA组HLA-IImRNA表达量是空白组的1.27倍,E7siRNA组HI,A}-IImRNA表达量是空白组的1.66倍,差异有统计学意义(P>0.05);无关序列组与空白组表达差异无统计学意义(P>0.05).以蛋白表达差异倍数(2一△Dc,值)做统计分析图(图2).　　4.Westernblot分析转染前后HPV18E6,E7的蛋白表达的差异:Westernblot结果显示,各组蛋白条带灰度基本一致,siRNA实验组HPVl8E6,E7蛋白条带灰度低于阴性对照组和无关序列组,蛋白表达结果E6shRNA,E7shRNA、无关序列和阴性对照组蛋白表达分别为0.0435,0.0670,0.5516和0.5576,HPV18Efi,E7蛋白表达明显低于阴性对照组(P<O.OS,P<0.01,图3).　　5.Westernblot分析转染前后HLA-II蛋白表达的差异:细胞经siRNA处理后48h}HLA-II蛋白表达量见图4,各组蛋白条带灰度基本一致,shRNA-E6,shRNA-E7、无关序列和阴性对照组蛋白表达分别为0.5543,0.7246,0.4452,0.4365,siRNAE6,E7实验组灰度稍高于空白组(P>0.OS)及无关序列组.　　讨论　　食管癌是威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一,我国属于食管癌高发区,而新疆地区又以哈萨克族为高发民族,其发病率和死亡率都高于新疆地区其他民族食管癌的发生是一个涉及多因素、多阶段、多途径相互作用的复杂过程.前期许多学者研究已证实HPV的感染是食管癌发生的一重要因素之一[5#j,研究结果显示食管癌的HPV感染中,最主要的是高危型HPV的感染,而HPV16和18在高危型HPV中占据着最重要的地位,尤其是高危型HPV的E6,E7基因的表达.HPVE6,E7基因编码的E6,E7蛋白是病毒原癌蛋白,能导致表达它的细胞基因损伤、细胞生长增殖失控、凋亡异常,是导致HPV相关肿瘤的重要因素之一,因此它成为HPV相关肿瘤基因治疗的理想靶点.　　HPV与食管癌的研究最早是1982年由Syrjanen开始.乳头瘤病毒具有明显的嗜上皮性,在生殖道、尿道、咽喉、鼻腔及鼻旁窦和腔等部位均检测到HPV感染.　　HPV与宫颈癌的密切关系已得到验证,但食管癌以及其他肿瘤中HPV的作用尚在研究中.Gillison等研究显示新疆哈萨克族食管癌患者HPV16E6病毒感染率明显高于哈萨克族正常人群.　　HIA基因系统是人类主要组织相容性复合体,位于人类第6号染色体短臂6p21.31的1组紧密连锁的基因群,是人类基因组中最复杂、最具多态性的遗传体系,正常体细胞除少数特定细胞(B淋巴细胞、巨噬细胞、激活的淋巴细胞、郎罕氏细胞等)外不表达HLA-II类分子,但肿瘤细胞例外.有研究者表明HPV存在于70%以上HLA基因异常中,进而证实由于HLA基因表达的缺失会使HPV获得潜在的致病机制,从而导致肿瘤生存增殖二sl.另有研究结果显示,已知细胞恶变过程中可获得肿瘤相关抗原并出现HLA-II表达异常,人类组织配合抗原(HLA-BR)在恶性肿瘤中表达的意义和作用近年来备受重视,许多学者研究证实HLA的多态性及异常表达与HPV感染致癌密切相关,且HPV可能通过使HLA-I和II类分子异常表达,干扰并阻碍其对病毒抗原和癌抗原的递呈、识别以及以及杀伤作用,从而使CD4+和CD8十T细胞的免疫监视功能发生障碍,造成HPV持续感染,肿瘤细胞发生逃逸「o-log,尤其是具有高度多态性的HLA-II类分子.近期研究结果显示,HLA-II类抗原由于多态性而导致的"免疫逃逸"在肿瘤的发生过程中也起着非常重要的作用m;,可能为HLA-II等位基因多态性与HPV感染及肿瘤发生相关.廖佩花等研究结果显示HPV16E6,HLA-DR9等位基因两者均为阳性的个体发生食管癌的风险远高于两者单独作用之和,两因素具有协同作用.Sheu等研究结果表明超过70%的H1.,A基因异常的官颈癌患者都存在HPV感染,且用Southernblot方法在HLA的突变位点检测到HPVDNA,Ayshamgul等在对新疆哈萨克族食管癌患者的研究中发现HLA-I在68%(34/50)的食管癌患者组织中表达下调或缺失,且其表达异常与HPV16感染密切相关.　　近些年关于HPV感染食管癌与HLA抗原分子关系的研究,都是在组织水平进行,我们选用HPV18阳性食管癌细胞株ECA109作为研究对象,从细胞水平体外转染食管癌细胞,探讨癌细胞中高危型HPV与HLA类抗原分子的相关性.本研究结果显示,HLA-II相关分子在HPV阳性食管癌细胞株中与HPVE6,E7基因表达有关,并且阻断E6,E7基因表达后,HLA-II相关分子表达会相应上调,从另一个侧面说明HPVE6,E7在食管癌中可能引起HLA-IIy鑫分子表达缺失,从而引起肿瘤细胞的免疫逃逸.我们通过腺病毒介导的RNA干扰技术,构建含有E民E7基因片段的shRNA腺病毒载体(shpAd-E6-eGFP,shpAd-E7-eGFP,并进行体外转染,以HPV18阳性食管癌细胞株ECA109为靶细胞,特异地抑制细胞中E6,E7基因的表达,从基因和蛋白两个水平印证HPVE6或E7基因的表达缺失可以使HLA-II重新表达或者表达上调,从而增加细胞毒性T淋巴细胞(cTL)对HPV感染细胞的清除机会,增强细胞的免疫原性,但具体机制尚待进一步研究.　　参考文献　　Tuschl T,Zamore PD,Lehmann R. 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