微小RNA-145通过调控上皮细胞间质化抑制肺腺癌起始细胞的发生

肿瘤起始细胞(CICs)理论当前受到广泛重视,CICs被认为是一小部分具有自我更新、无限增殖、分化等干细胞潜能的细胞群,是肿瘤不断复发转移、难以治愈的根源f>>.现有证据表明,CIC、不但可能来源于恶变的正常干细胞,亦可由已分化的细胞通过上皮一间充质转化(EMT)"去分化"而重新获得十细胞样特性,但其调控机制尚不完全清楚.新近研究表明,微小RNA(miRNA)可通过干预肿瘤细胞自我更新相关信号通路影响EMT,从而调控肿瘤的干细胞特性.我们前期研究结果显示,miR-145在肺腺癌组织中较正常组织普遍低表达,可抑制肺腺癌细胞株A549中CIC、增殖,是可能的抑癌基因"l,但其具体分子机制尚不清楚.本研究旨在探讨miR-145是否可能通过调控EMT来抑制肺腺癌CIC、的发生.　　材料与方法　　1.材料:肺腺癌细胞株A549购于中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库,DMEM/F12培养基购于Hyclone公司.超低载附性24孔培养板购于Corning公司,上皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子((3-FGF)购于BD公司,胰岛素购于Sigma公司.　　miR-145模拟物、阻遏物、miR-145模拟物阴性对照和阻遏物阴性对照购于美国ABI公司.转染试剂Lipo-fectamine2000购于Invitrogen公司.miRNA提取试剂盒及逆转录试剂盒,实时定量聚合酶链反应(Real-timePCR)试剂盒、引物miR-145和内参RNU6BMGB探针标记的引物购于美国ABI公司.RNA提取试剂盒Trizol试剂购于Invitrogen公司,PCR逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购于TaKaRa公司.E一钙勃蛋白(E-cadherin),N一钙勃蛋白(N-cadherin)、波形蛋自(Vimentin)、角蛋白18(Cytokeratin18),Snail,Slug,阶肌动蛋白((3-actin)一抗购于CellSignalingTechnology公司,辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购于北京中杉金桥生物科技有限公司,CD133一抗购于CellSignalingTechnology公司,AlexaFluor594标记的二抗购于Invitrogen公司.　　2.细胞培养和转染:采用无血清培养方法富集A549起始细胞微球用于实验.实验分组:miR-145模拟物转染组、阻遏物转染组、模拟物阴性对照转染组、阻遏物阴性对照转染组和只加转染试剂的无处理组.采用Invitrogen公司Lipofectamine200()试剂盒在超低豁附性24孔培养板进行转染,每孔加人10pmol模拟物和4闪转染试剂,使模拟物的终质量浓度为10nmol/L,转染后Sh换液,每组设3个复孔,实验重复3次.　　3.Real-timePCR检测miRNA的相对定量:转染48h收获的细胞样品,RNA的提取、逆转录和PCR反应均严格按照ABI公司提供的TaqmanmiRN.　　4Assay的方法,以RNU6B作为内参进行相对定量,每组设置3个复孔,在ABI7300Real-timePCR不交卜讲行检a}}il-自配的10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)一磷酸盐缓冲液(PBS)消化细胞,采用间接标记方法检测各组CD133+细胞比例.流式细胞仪为FACSCalibu(美国BD公司),分析软件为Flo07.6版本.　　5.Westernblot蛋白水平检测:在转染后72h收获细胞,以p-actin为内参,分别检测E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,Cytokeratin18,SnailSlug的蛋白表达水平.采用ImageJ软件对条带的灰度值进行分析6.统计学方法:应用SPSS16.0统计软件分析.数据以均数士标准差(、士、)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA),数据图表采用Graphic-padPrism5.0软件制作.　　结果　　1.Real-timePCR检测各组miR-145的表达水平:miR-145模拟物转染组的miR-145表达是空白对招组班(12.99士0.21)倍(P<0.01),阻遏物转染组miP}-l}}a7表达水平是空白对照组的(0.2610.01)倍(P<0.01)它表明miR-145模拟物明显促进了A549趁万细抱中miR-145的表达,而miR-145阻遏物则明毛却制miR-145的表达.　　2.细胞微球形成的定量分析:对9起始细胞微球进行定量分析的结果表明,与对照组北较,过表达miR-145可显著降低起始细胞微球数_(9.00士2.54)比(22.00士4.48),P<0.05],而抑制miPL-1-15表达微球数显著增加[(44.00士5.10)比(2}.6715.31),P<0.O1].　　3.流式细胞术检测CD133-微球定量分析:miR-145模拟物组中CD133'细胞比例为(25.39士12.37)%,miR-145模拟物阴性对照组(43.70=17.58)%比较明显降低(P<0.O5);miR-145阻遏厂纽中CD133十细胞比例为(58.89123.54)%,与二iP-_-阻遏物阴性对照组仁(45.60士18.‘58)%〕比救班三二高(P<0.05).　　4.miR-145对EMT相关蛋白表达P_%--:W表达miR-145可下调EMT相关转录因子mail〕一:司充质细胞标志Vimentin,N-cadherin的蛋上哥上皮细胞标志E-cadherin,Cytokeratin18}蛋三.:平:而抑制miR-145则明显上调Snail,Slug,}imentin,\-cadherin的蛋自水平,下调上皮细胞标志E-cadhrnn,C}tokeratin18的蛋白水平(图1).　　讨论　　EMT是指上皮细胞在生理及病理情况下发生的向间质细胞转化的形式.其主要表现为上皮细胞失去细胞豁附结构,呈现出间质细胞表型,具有高度的能动性和攻击性〔5〕现已证实其可能参与调控肿瘤细胞的侵袭、抗凋亡等过程〔并且可能参与诱导已分化的肿瘤细胞向CIC*转化的过程.　　miRNA被认为在细胞增殖、凋亡等各个方面都起到重要作用〔6p,新近研究结果显示,miRN_4可通过调控EMT来调节肿瘤干细胞特性.miR-200家族可通过抑制Notch通路相关基因B细胞特异的莫洛尼自血病病毒插人位点1基因(Bmil),Jagl,Maml2,Mam13及锌指E一盒结合同源异形盒一1(ZEB1)影响乳腺癌、前列腺癌细胞株的EMT进而影响其CSCs特性u:;在乳腺癌细胞中,miR}.48表达下调可通过调控特异性核基质结合区结合蛋白一1(SATBI)基因并与核因子KB(NE-KB基因之间建立正反馈机制,从而促进EMT的发生i8}.　　已有研究证实,miR-145在多种肿瘤中是1个抑癌基因,并且在人类干细胞的生长和分化中占据重要作用[9〕.在前期研究中,我们利用miRNA微流体微阵列芯片对大样本肺癌组织进行miRNA表达谱研究结果显示:miR-145几乎在所有患者肿瘤组织中均较癌旁正常组织表达显著下调.随后,以人肺腺癌细胞株A549为研究对象,我们发现miR-145可显著抑制S期细胞比例从而抑制DNA合成,并且过表达miR-145可显著抑制A549细胞增殖~4].同时,我们在前期研究中发现,在A549细胞株中miR-145可通过调控其下游靶基因Oct4来抑制肺腺癌细胞的干细胞样特性,参与调节CD133十细胞的比例,而CD133+被认为是肺癌起始细胞的标志.因此提示miR-145可能参与调控肺癌起始细胞的发生.而新近研究结果显示:过表达Oct4基因可显著促进肺腺癌细胞EMT,从而增加CD133表型、微球形成能力等干细胞样特征.因此,我们认为,通过调控EMT是miR-145抑制肺癌起始细胞发生的重要机制.　　为了阐明miR-145调控肺癌起始细胞发生的可能机制,首先,我们采用上皮生长因子及成纤维细胞生长因子刺激的无血清培养方法富集肺癌起始细胞微球,通过进行miRNA模拟物及阻遏物的转染来促进和抑制miR-145的表达.运用流式细胞术定量检测各组CD133的表达比例.过表达miR-145可明显下调A549起始细胞微球中CD133细胞的比例,而抑制miR-145的表达可明显增加CD133+细胞的比例.本研究结果显示,过表达miR-145可下调EMT相关转录因子Snail,Slug,间充质细胞标志Vimentin,N-cadherin的蛋白表达水平,上调上皮细胞标志E-cadherin,Cytokeratin18的蛋白水平;而抑制miR-145则明显增加Snail,Slug,Vimentin,N-cadheri.的蛋自水平,下调上皮细胞标志E-cadherin,Cvtokeratin18的蛋白水平.　　这些结果表明,miR-145可能通过A549起始细胞内的EMT通路来调控起始细胞的发生.本实验结果表明miR-145可抑制肺腺癌起始细胞的发生,其机制可能与调控EMT通路有关.　　参考文献　　Alison MR,Lim SM,Nicholson LJ. Cancer stem cells:problems for therapy[J].Journal of Pathology,2011.147-161.　　Mani SA,Guo W,Liao M J. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells[J].Cell,2008,(4):704-715.　　Brabletz S,Bajdak K,Meidhof S. The ZEB1/miR-200 feedback loop controls Notch signalling in cancer cells[J].EMBO Journal,2011.770-782.　　Yin R,Zhang S,Wu Y. microRNA-145 suppresses lung adenocarcinoma-initiating cell proliferation by targeting OCT4[J].Oncology Reports,2011.1747-1754.　　Singh A,Settleman J. EMT,cancer stem cells and drug resistance:an emerging axis of evil in the war on cancer[J].Oncogene,2010,(34):4741-4751.　　南阳,钟跃,康春生. microRNA-451对人脑胶质瘤细胞株A172增殖和凋亡的影响[J].中华实验外科杂志,2010,(10):1375-1377.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2010.10.002.　　虞亦鸣,周浩杰,谭云山. erbB4/HER4在胃癌的表达[J].中华实验外科杂志,2008,(11):41.doi:10.3321/j.issn:1001-9030.2008.11.034.　　Li QQ,Chen ZQ,Cao XX. Involvement of NF-kappaB/miR-448 regulatory feedback loop in chemotherapy-induced epithelial-mesenchymal transition of breast cancer cells[J].Cell Death and Differentiation,2011.16-25.　　Chivukula RR,Mendell JT. Abate and switch:miR-t45 in stem cell differentiation[J].Cell,2009.606-608.　　Chiou SH,Wang ML,Chou YT. Coexpression of Oct4 and Nanog enhances malignancy in lung adenocarcinoma by inducing cancer stem cell-like properties and epithelial-mesenchymal transdifferentiation[J].Cancer Research,2010.10433-10444.