黄芪多糖通过激活线粒体凋亡途径诱导食管癌EC9706细胞的凋亡并增加其对顺铂的敏感性

中药黄+r为豆科植物蒙古黄蔑或荚膜黄蔑干燥块茎,其中黄蔑多糖为中药黄茂抗肿瘤的主要有效成分,其可能通过增强机体免疫力,减轻化疗的不良反应以及增加其他药物的疗效而发挥抗肿瘤作用,但其与其他药物联合的抗肿瘤机制尚未完全明确.本研究旨在探讨黄茂多糖促进食管癌细胞凋亡及与顺铂联合的协同效应机制.　　材料与方法　　1.材料:人食管癌EC9706细胞株由本实验室保存.RPMI1640培养液购自美国Hyclone公司;胎牛血清(FBS)购自Gibco公司,窿哩蓝(MTT)、膜联蛋白V(AnnexinV),碘化丙锭(PI)购自Sigma公司;黄蔑多糖购于哈药集团制药六厂;顺铂购于上海旭东制药厂;B淋巴细胞/白血病一2(bcl-2),bcl-2相关X蛋白(bax),核因子一KB(NF-KB),(3一肌动蛋白((3-actin)单克隆抗体购自SantaCluz,链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶(SP)试剂盒购于北京中杉金桥公司.　　2.细胞培养:采用人食管癌细胞株EC9706,接种于100ml玻璃培养瓶中,在含体积分数10%新生小牛血清的RPMI1640培养基中贴壁生长,于370C,5%COZ饱和温度培养箱中培养.细胞贴壁生长,每2-3d传代1次.　　3.分组与处理:黄蔑多糖组(H组),包括Hl,H2,H3,H4和HS共5个浓度点,其在培养中的终质量浓度分别为0.爪1.0,2.0,4.0,8.0剔L;顺铂组(S组),包括Sl,S2,S3,S4和SS共5个浓度点,其在培养中的终质量浓度分别为1.25,2.50,5.00,10.00,20.00m郭L;联合用药组(r.组),以黄茂多糖的H3浓度和顺铂的S2浓度联合应用;空白对照组(0组)不加药,以等量培养液代替.　　4.M'I'T试验:将对数生长的EC9706细胞以2x10'/L浓度200闪接种于%孔培养板上,RPMI1640培养基孵育24h后,倾去培养液.将H,S组的药物分别加人孔内,每孔加200},l,对照组加同量培养液.孵育24h后,倾去药液及培养液,每孔加人MTT(5群工)20闪培养4h,倾去药液及培养液,每孔加人二甲基亚矾(DMSO)150},l,平板振荡仪振荡100min,在2500酶标仪上以490nm波长检测各孔吸光度(9)值,计算抑制率(%)(1一各药物浓度组A值)/对照组A值x100%.　　5.流式细胞仪检测不同药物作用细胞凋亡:将对数生长的人食管癌细胞调整浓度至2x108/L细胞悬液,2ml/孔接种于6孔板,RPMI1640培养基孵育48h后,分别加人H3,S2,L组各处理组药物,继续培养24h,收集各处理组EC9706细胞,用磷酸盐缓冲液(PB幻洗涤细胞,二次收集1x105一5x105个细胞,加入5000,1的结合缓冲液悬浮细胞,加人5闪llnnexinV/异硫氰酸荧光素(FITC)混匀后,再加人PI10闪,旋涡混匀,室温避光染色15min;加人300闪结合缓冲液,进行流式细胞仪的观察和检测.　　6.细胞免疫化学:常规制作细胞爬片,培养48h后,4%多聚甲醛溶液固定.按免疫组织化学SP法步骤进行,用PBS代替一抗作为阴性对照.bcl-2,bax主要在胞质表达,NF-rcB多定位于胞质,少数表达于胞核,呈棕黄色,空白对照呈阴性.200倍镜下随机取5个视野,计算每个视野阳性细胞数,平均阳性细胞数占总计数细胞的>10%者为阳性,平均阳性细胞数<10%者为阴性(包括没有或仅有弱的染色),阳性反应者用德国LeicaQ550cw图像分析系统在统一光强、统一放大倍数(200x)下测量蛋白表达,以染色最淡的视野为起点,随机选取视野测定其灰度值作为阳性表达的量化指标,并进行统计学分析.　　7.Westernblot检测蛋白表达:收集药物作用后的EC9706各组细胞,提取总蛋白,用超微量紫外分光光度仪定量蛋白.十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE),半干法转膜.50州L脱脂奶粉窒温封闭1h;lxTEST稀释一抗,4℃过夜;TEST洗膜4次;TBST稀释二抗室温45min,洗膜3次,化学发光法显色,X线胶片进行显影、定影、图像分析.　　8.统计学方法:数据用均数士标准差(无士、)表示,应用SPSS13.0统计软件分析,采用独立样本t检验.　　结果　　1.不同药物组对EC9706细胞生长的抑制作用:黄蔑多糖及顺铂不同浓度分别对食管癌EC9706细胞作用24h后的细胞增殖抑制率比较.结果显示,黄蔑多糖和顺铂对EC9706细胞增殖抑制作用均随浓度升高而逐渐升一高;2g/L浓度黄蔑多糖对细胞生长抑制强度与2.5mg/L浓度的顺铂相似(表1).　　2.不同药物组对EC9706细胞凋亡的影响:选择黄茂多糖的H3浓度及顺铂的S2浓度进行实验,采用Annexin-V/PI双染法,应用流式细胞仪检测各组药物分别及联合作用EC9706细胞48h后其凋亡,可见两个单药处理组和药物联合组均高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05),黄蔑多糖诱导细胞凋亡能力很弱,低于顺铂(P<0.05),但两药联合组促凋亡能力高于任何1个单药处理组(P<0.OS,图1)3.黄蔑多糖作用前后EC9706细胞中bcl-2,bax蛋白表达的比较:正常bcl-2,bax蛋白主要在胞质表达,呈棕黄色均匀染色为阳性表达.对bcl-2,bax表达阳性的样本行图像分析,测其灰度值作为其表达强度的量化指标.灰度值与实际表达强度成反比,即灰度值越低,阳性表达越强;灰度值越高,阳性表达越弱.　　bcl-2在黄蔑多糖作用48h后表达降低,而bax表达上升,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05,表2)oWesternblot结果也显示,与空白对照组比较,黄蔑多糖降低bcl-2表达,提高bax的表达(图2).　　4顺铂及黄蔑多糖联合顺铂作用前后EC9706细胞中NF-KB蛋白表达的比较:正常NF-KB蛋白主要在胞质表达,部分表达于胞核,呈棕黄色均匀染色.对阳J性表达的样本行图像分析,测其灰度值作为其表达强度的量化指标.不同药物作用48h后,空白对照组细胞中NF-KB灰度值为140.21土14.75,顺铂组灰度值为114.38士12.17,差异有统计学意义(尸<0.05),黄茂多糖联合顺铂组FC9706细胞中NF-KB表达灰度值为131.66118.83,与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),与顺铂组比较差异有统计学意义(P<0.OS)oWesternblot结果显示,药物作用48h后,顺铂组IKB磷酸化(pIKB耐蛋白表达强度高于黄蔑多糖联合顺铂组(图3).　　讨论　　黄蔑多糖在体外体内实验都显示出其一定的抗癌效果,可抑制多种肿瘤细胞的增殖和诱导其凋亡bcl-2蛋自家族中的促凋亡蛋白如bax}bad和bid以及抑制凋亡蛋白bcl-2和bcl-xL之间保持着一定平衡,调节着细胞的线粒体凋亡途径,许多抗肿瘤药物就是通过上调bax/bad/bid蛋白或下调bc1-2/bcl-xL蛋白而促进细胞凋亡·4-5.本研究结果证实黄蔑多糖以浓度依赖性的方式,通过抑制EC9706细胞增殖和诱导其凋亡而发挥抗肿瘤作用,此过程中,黄茂多糖明显降低了EC9706细胞中bcl-2蛋白的表达,并提高了bax蛋白的表达,可以推断,通过降低bcl-2/bax表达比例而诱发线粒体凋亡途径是黄蔑多糖促进食管癌EC9706细胞凋亡的一个重要机制.抗肿瘤治疗中,不同作用机制的药物联合应用往往可起到效应叠加的效果,并能一定程度降低或避免单一药物长期应用所导致的细胞耐药情况,所以,鉴于黄蔑多糖的作用机制,其与非线粒体凋亡途径依赖性的抗肿瘤药物联合,或能发挥更好的抗癌功效.有研究结果表明,化疗药物促进NF-rcB的激活和高表达,是导致肿瘤细胞抗凋亡的一个重要因素〔61.本实验结果显示,顺铂作用EC9706细胞48h后,虽然促进了一定数量的细胞凋亡,但是pIKBa与NF-KB的表达也明显上升,预示着进一步的药物治疗将难以取得应有的疗效,这与临床所面临的化疗失败性质相似,推测在顺铂治疗过程中,可能激活和/或诱导NF-KB的高表达,从而诱发了细胞耐药.而黄蔑多糖与顺铂联合治疗组并未出现p1KB.和NF-rcB的高表达,结合其远高于顺铂单药的诱导凋亡能力,在此过程中,黄蔑多糖通过抑制NF-KB的表达,保持了EC9706细胞对顺铂敏感性,发挥一了其化疗士曾敏的作用.　　参考文献　　Xu HD,You CG,Zhang RL. Effects of Astragalus polysae-eharides and astragalosides On the phagocytosis of Mycobacteriumtuberculosis by rnacmphages[J].Journal of International Medical Research,2007.84-90.　　孙聪,韩业超,洪敏. 黄芪多糖抑制大鼠神经胶质瘤细胞增殖的实验研究[J].中国老年学杂志,2009,(1):41-43.doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2009.01.018.　　董竞成,董晓辉,赵福东. 黄芪注射液对肺癌治疗作用的实验研究[J].中华肿瘤杂志,2006,(4):272-273.doi:10.3760/j.issn:0253-3766.2006.04.009.　　周勇,刘冰阳,刘源. Survivin基因在胆管癌组织中的表达及其与bcl-2和bax相关性[J].中华实验外科杂志,2009,(5):603-605.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2009.05.021.　　李明意,赵家明,杨展. 靶向bcl-2基因SteahhTM RNA干扰诱导肝癌细胞凋亡的作用[J].中华实验外科杂志,2008,(3):313-315.doi:10.3321/j.issn:1001-9030.2008.03.014.　　陈庆,陈虎,郑海. 抑制核转录因子-κB活性对SGC7901/VCR细胞mdrl表达及凋亡的影响[J].中华实验外科杂志,2010,(8):1066-1068.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2010.08.019.