协同刺激分子B7-H3在食管癌中的表达

协同刺激分子B7-H3是新近发现的B7家族重要成员虹.研究结果显示B7-H3在多种肿瘤中异常表达,如胃癌、结直肠癌、肾癌等,且其表达水平和患者多项临床病理参数及预后等密切相关.鉴于B7-H3分子的受体尚未明确,B7-H3分子在肿瘤免疫应答中的作用及机制PJ}待研究.本研究旨在检测协同刺激分子B7-H3在人食管癌细胞株及食管癌组织中的表达并探讨其临床意义.　　材料与方法　　1一般资料:胎牛血清(FBS),RPMI1640及DMEM培养基购自美国Gibc.公司;羊抗人B7-H3多克隆抗体购自美国R&D公司;藻红蛋白(PE)标记鼠抗人B7-H3单抗(MIH42)及PE标记小鼠IgGl均购自美国eBioscience公司;山羊超敏二步法免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉金桥生物科技有限公司;人食管癌细胞株TE-1,Eca-109购自上海中国科学院细胞库,TE-1选用含10%FBS的DMEM培养基、Eca-109选用含10%FBS的RPMl1640培养基在标准条件下(37℃,5%COZ)进行培养;食管癌组织标本取自2003年5月至2006年5月在苏州大学附属第三医院收治的174例食管癌手术患者,术后均经病理诊断确诊为鳞状细胞癌,其中男128例,女46例.年龄37一76岁,中位年龄59岁.同时选取6例食管正常组织作为对照.所有患者术前均未接受放疗或化疗,所有患者均有详细的临床资料和随访资料,术后所取组织标本经10%甲醛固定、石蜡包埋后待用.　　2.流式检测及分析:人食管癌细胞株TE-1,Eca-109在体外进行扩增培养后,经流式细胞术检测细胞膜表面B7-H3分子的表达;检测结果经Flow).流式数据分析软件进行分析.　　3.免疫组织化学染色及评估:组织切片经脱蜡、水化、抗原修复后,3%牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭30min后,经一抗(羊抗人B7-H3多克隆抗体,2.5mg/L)4℃孵育过夜,经磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤、聚合物辅助剂及多聚辣根过氧化物酶(HRP)标记抗山羊IgG在37℃分别孵育20min后,二氨基联苯胺(DAB)显色、苏木素复染及中性树脂封片.由2位病理医师采用双盲法进行结果判定,B7-H3免疫组织化学染色评分采用H-scor.法,H-score=(无着色的肿瘤细胞百分率x0)十(弱着色的肿瘤细胞百分率x1)+(中度着色的肿瘤细胞百分率x2)+(强着色的肿瘤细胞百分率x3).　　4.统计学方法:应用(GraphPadPrism5.0统计软件分析,采用丫检验或Log-rank生存分析.　　结果　　1.B7-H3在人食管癌细胞株中的表达:流式检测结果显示,B7-H3分子在Eca-109中呈弱表达,在TE-1中呈高表达.　　2.B7-H3在食管癌组织及癌旁正常组织中的表达:B7-H3蛋白主要定位于肿瘤细胞的胞质及胞膜;免疫组织化学染色评分H-score结果显示,174例食管癌组织中B7-H3染色的H-score中位值为200.0,最小值为0,最大值为292.S;B7-H3在食管正常组织中以不表达或低表达为主.　　3.B7-H3在食管癌组织中表达水平的临床相关:食管癌组织中B7-H3表达水平与肿瘤浸润深度(T分期)明显相关(=5.411,Y<0.O5);B7-H3在食管癌中的表达水平与患者的其他临床病理参数如性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移及TNM分期等无明显相关(P>0.O5,表1).　　4.B7-H3在食管癌组织中的表达水平与患者预后的关系:通过选取不同的B7-H3染色评分作为Cut-off值纳人生存分析,当选取B7-H3染色H-scor.二125作为Cut-off值,即B7-H3染色评分H-score>125的患者定义为B7-H3高表达组,B7-H3染色H-score,125的患者定义为B7-H3低表达组,生存分析结果显示,B7-H3高表达的患者其术后总生存率显著低于B7-H3低表达的患者(OR=1.-564,95%CI.1.040一2.351,P<0.O5,图1).　　讨论　　业已证实B7家族的一些负性分子(如B7-Hl,B7-H4等)在多种上消化道肿瘤组织中异常表达,且其表达水平具有密切的临床相关性「69〕.B7-H3是B7家族的重要成员,研究结果显示B7-H3在多种肿瘤组织中异常表达,如胃癌、结直肠癌、肾癌等,且其表达水平和患者多项临床病理参数及预后密切相关;,提示B7-H3参与肿瘤的发生发展.本研究中我们通过免疫组织化学法检测B7-H3在食管癌组织中的表达,发现B7-H3在食管癌组织中高表达,其表达水平与肿瘤浸润深度明显相关,且B7-H3高表达的患者术后总生存率显著差于B7-H3低表达的患者.这些结果提示B7-H3参与食管癌的发生和发展,并可能作为一个肿瘤免疫应答中的负性调控因子,参与肿瘤免疫逃逸机制.鉴于B7-H3在食管正常组织中不表达或低表达为主,在食管癌组织中高表达,因此,B7-H3可作为食管癌诊断和预后判断的潜在指标许多肿瘤细胞株中可检测到B7-H3分子的表达'-3,I0-llj.我们通过流式检测发现B7-H3分子在人食管癌细胞株Eca-109中呈弱表达,而在TE-1中呈高表达.Liu等发现,前列腺癌组织中B7-H3的表达水平和细胞增殖标志细胞核增殖抗原(Ki-67)的表达呈正相关.进一步研究结果显示采用RNA干扰下调前列腺癌细胞株PC-3中B7-H3分子的表达后,肿瘤细胞的载附、迁移和侵袭能力显著下降,提示肿瘤细胞上异常表达的B7-H3不仅参与调控T细胞介导的肿瘤免疫应答,而且参与调控肿瘤细胞自身的一些生物学特性.　　本研究结果证实,B7-H3在食管癌组织中高表达,并与肿瘤浸润深度及患者预后密切相关.B7-H3参与食管癌的发生与进展,是一个潜在的食管癌临床诊疗的重要指标.但B7-H3在肿瘤免疫应答中的作用机制及对肿瘤细胞自身生物学特性的影响尚有待进一步研究.　　参考文献　　Chapoval AI,Ni J,Lau JS. B7-H3:a costimulatory molecule for T cell activation and IFN-gamma production[J].Nature Immunology,2001.269-274.　　Wu CP,Jiang JT,Tan M. Relationship between co-stimulatory molecule B7-H3 expression and gastric carcinoma histology and prognosis[J].World Journal of Gastroenterology,2006,(3):457-459.　　Sun J,Chen LJ,Zhang GB. Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H3 in human colorectal carcinoma[J].Cancer Immunology Immunotherapy,2010.1163-1171.　　Ingebrigtsen VA,Boye K,Tekle C. B7-H3 expression in colorectal cancer:Nuclear localization strongly predicts poor outcome in colon cancer[J].International Journal of Cancer,2012.2528-2536.　　Crispen PL,Sheinin Y,Roth TJ. Tumor cell and tumor vasculature expression of B7-H3 predict survival in clear cell renal cell carcinoma[J].Clinical Cancer Research,2008,(16):5150-5157.doi:10.1158/1078-0432.CCR-08-0536.　　Chen L J,Sun J,Wu HY. B7-H4 expression associates with cancer progression and predicts patient's survival in human esophageal squamous cell carcinoma[J].Cancer Immunology Immunotherapy,2011.1047-1055.　　吴晁,谢军,陈陆俊. 协同刺激分子B7-H1在食管癌中的表达及其临床意义[J].中华实验外科杂志,2012.913.　　蒋敬庭,吴昌平,沈月平. 共刺激分子B7-H4在胃癌组织中表达及其与预后的关系[J].中华实验外科杂志,2009,(9):1155-1158.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2009.09.026.　　赵瑶,蒋敬庭,吴昌平. 恶性肿瘤的死亡风险与协同刺激分子B7-H4表达的关系[J].中华实验外科杂志,2010,(11):1732-1734.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2010.11.058.　　Arigami T,Uenosono Y,Hirata M. B7-H3 expression in gastric cancer:a novel molecular blood marker for detecting circulating tumor cells[J].Cancer Science,2011.1019-1024.