唑来膦酸诱导结肠癌HCT116细胞株凋亡分子的研究

表皮生长因子受体(EGFR)-Ras-Raf信号通路在结肠癌患者中多有异常活化，其原因有EGFR异常表达、磷酸化水平异常、也有K-Ras外显子突变、13-Raf突变等多种因素。使用西妥昔单抗等药物阻断表皮生长因子(EGF)与EGFR的结合，从而阻断EGFR的二聚化和酪氨酸残基磷酸化，进而阻断EGFR-Ras-Raf通路可达到对结肠癌进行有效的治疗目的。但是，K-Ra、是否突变，尤其是第11,12号外显子是否突变，直接影响到FGFR靶向治疗的治疗效果。对于K-Ras野生型的患者，美国国立综合癌症网(NCCN)指南已有明确的建议，但是对于K-Ras突变型的患者，临床治疗仍为传统的FOLFOX,FOLFIRI等方案L67寻找有效的突变型K-Ra、靶向治疗药物是目前临床和基础研究的热点之一。基于对K-Ras分子机制的前期研究，K-Ras为小G蛋白家族成员之一，其在细胞内合成后，需经过法尼基化才能转运至细胞膜发挥信号转导的作用iy。K-Ras法尼基化的过程受到3-经-3一甲戊二酞辅酶A(HMG-CoA)还原酶通路的调控。而临床较为常用的第3代含氮双嶙酸盐如哇来麟酸等正是通过抑制HMG-CoA还原酶通路的关键酶法尼基焦磷酸合成酶和牛儿基焦磷酸合成酶，阻断异戊烯GTP酶的形成u-y。本研究旨在探讨哩来磷酸诱导结肠癌细胞株凋亡的分子机制与信号通路。　　材料与方法　　1.材料:DMEM培养基和胎牛血清均购自美国Hvclone公司，膜联蛋白Y一异硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)和碘化丙锭(PI)双染试剂盒购自美国Invitrogen公司，JC-I染料、苯甲基磺酞氟(PMSF)的线粒体裂解液、辣根过氧化物酶标记二抗和增强化学发光(ECL)试剂盒购自南京碧云天生物技术研究所鼠抗人细胞色素C(CyclinC)单克隆抗体和兔抗人甘油醛_3_磷酸脱氢酶(GAPDH)的多克隆抗体均购自美国SantaCruz公司。其他试剂为分析纯。　　2细胞培养:人结肠癌细胞株HCT116源自美国模式培养物集存库(,ATCC)，由本实验室保存和培养细胞培养基为DMEM培养基加人10%胎牛血清，置于5%C02,370C、饱和湿度的培养箱中培养，常规培养和冻存。　　3.哇来麟酸诱导细胞凋亡分析:使用浓度为0.25,50N.,mol/L的哩来嶙酸孵育HCT116细胞48h后，含有乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋自酶(0.1%)消化细胞获得单细胞悬液。预冷磷酸盐缓冲液(PB劝洗涤后，每管加人lx结合缓冲液重悬细胞_4%多聚甲醛固定后，每管加人5闪AnnexinV-Fl'I'C和500闪PI混匀，避光孵育ISmin最后以400闪lx结合缓冲液重悬细胞，流式细胞仪(BDBiosciences公司，美国)检测。　　4.线粒体膜电位分析:使用JC-1染料分析哗来磷酸作用后，HCTl1b细胞线粒体膜电位么平的改变。将已制备的HCT116细胞爬片，用不同浓度的哩来嶙酸孵育24,48,72h,PBS洗涤后，使用JC-1避光孵育15min,PBS漂洗后，于荧光显微镜下摄片.另取对数生长期5x106个HCT116细胞，在哩来嶙酸作用24,48,72b后，消化为单细胞悬液，PBS漂洗后加人0.5ml(1mmol/I)的JC-1避光孵育15min,PBS再次漂洗重悬后使用流式细胞仪分析。　　5.分离和结肠癌细胞株线粒体与细胞质:不同浓度的哩来麟酸处理HC}I'l16细胞48,,72h后，收集细胞，预冷的PBS(pH二7.5洗2次，取5x10'个细胞，加人5倍体积的裂解缓冲液。将细胞在玻璃匀浆器中匀浆60次，然后分别在750g和10000g条件下4℃离心10min。上清液为HCT116细胞的细胞溶质，管底沉淀为线粒体。　　6.Westernblot实验:在线粒体沉淀中加人200},l含PMSF的线粒体裂解液提取线粒体蛋白质，同时提取细胞质总蛋白。分别取20闪的细胞质总蛋白和线粒体蛋自卜样于10%的十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(5DS-PAGE)胶，转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜;以脱脂奶粉封闭后，分别于4℃以1:1000的浓度稀释的C}}clinC单抗以及GAPDH抗体孵育过夜，洗膜后，并孵育二抗1h;用EC1显色、压片。用灰度软件扫描各组灰度值。　　7.统计学方法:应用S.AS9.0统计软件分析，细胞凋亡结果和线粒体膜电位改变采用方差分析。　　结果　　1.不同浓度和时点哩来嶙酸诱导HCT116细胞凋亡的作用:取对数生长期细胞将0,25,50}..t,mol/L哩来嶙酸加入完全培养基中，孵育HCTl16细胞48h后，使用AnnexinV和Pl染色，进行流式细胞仪分析。每个浓度都分别设3个复孔。结果显示:在哩来麟酸作用下，HCTl16细胞出现凋亡和死亡，并且凋亡比例随着哩来嶙酸作用的浓度增加而增加[(11.6士0.5)070,25},,mol/1，48h;(49.2士3.4)%，50N.,mol/L，48h。进行组间方差分析，差异有统计学意义(F'=18.296,p<0.O1)。　　2.哩来嶙酸介导线粒体膜电位的功能异常:JC-1为标示线粒体膜电位功能的染料之一。在正常细胞中，JC-1被线粒体富集，形成多聚体，可被激发出红色荧光而在线粒体膜电位降低时，线粒体膜通透性增加，JC-1多以单体形式存在，被激发出绿色荧光。本研究分别使用25}Amol/L和50N.,mol/L哩来麟酸孵育HC`I'l16细胞24,48和72h后，细胞内红色荧光逐渐减弱，提示随着时间的推移，HCT116细胞线粒体膜的稳定性下降，导致线粒体聚集JC-1的能力下降。实验结果显示，在哩来磷酸的作用下，随着时间的推移HCT116细胞红色荧光强度逐步降低，而绿色荧光强度逐步增加，显示了[Gj}来磷酸作用下HCT116线粒体膜通透性改变的动态变化。被激发出红色荧光的细胞比例为(96.491'2.10)%(哩来嶙酸浓度25,mol/L,作用24h);(86.13士3.20)%哩来嶙酸浓度25}mol/L，作用48h);(74.23士5.30)%(哩来麟酸浓度25}mol/L，作用72h)。方差分析可见F=15.89，差异有统计学意义(P<0.01)3.CvclinC从线粒体中释放到细胞质中:图1显示了CyclinC随着时间推移，而逐步从线粒体释放至胞质的过程。Westernblot结果，25},i,mol/L的哩来嶙酸作用72h后，HCT116细胞线粒体的CyclinC含量降低，而同时细胞质CyclinC的增加，提示Cy<;linC在哩来嶙酸作用下，逐步释放的过程二当哩来嶙酸浓度提高到50}t,mol/L时，这种作用更为明显。　　讨论　　我们经哇来嶙酸孵育结肠癌细胞株HCT116后可见，JC-1在线粒体内的聚集明显减少，证明了肿瘤细胞线粒体膜电位稳定性下降，导致了线粒体膜的通透性明显增加，线粒体内的CvclinC外渗。细胞质CyclinC浓度升高是启动半胧氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Gaspase)激酶家族发生级联反应的重要环节，结合Sewing等厂1}J的研究结果，我们补充完成了噢来麟酸通过线粒体途径诱导细胞凋亡的信号通路，即A}来磷酸诱导了新型ATP类似物(ApppI)和B淋巴细胞/白血病一2(bcl-2)基因家族的异常表达，引起了线粒体膜的功能障碍，然后促使CyclinC从线粒体释放到细胞质中激活Caspase途径。　　2003年，Monkkonen等「m报道了含氮的双嶙酸盐如p}}来嶙酸可以抑制细胞内甲轻戊酸途径的关键酶法呢基焦磷酸(FPP)的合成，继而阻止小G蛋白的异戊烯基化，并阻断小G蛋白转运及与细胞膜的结合，从而导致小G蛋白信号转导的功能损失，进而诱发细胞凋亡。除此之外双嶙酸盐诱导肿瘤细胞凋亡分子机制还包括异戊烯焦磷酸(IPP)的代谢异常。A}}来嶙酸对FPP合成酶的抑制作用使得IPP在胞内积累，并由氨酞-tRNA合成酶转变成APPPI-1z},}APpPI抑制线粒体的ATP代谢，从而促发了肿瘤细胞的凋亡〔m。线粒体膜电位的稳定性同样受到bcl-2家族成员的调节。　　既往的研究证明肿瘤细胞经过哩来嶙酸孵育后，其抗凋亡蛋白bcl-2表达水平下调，促凋亡蛋白bax的表达上调〔14]。上述研究结果提示线粒体途径可能是哗来嶙酸诱导细胞凋亡的重要途径之一。　　哇来嶙酸诱导结肠癌细胞株线粒体途径的凋亡是基于抑制K-Ras等小G蛋白法尼基化的作用进行的，其诱导结肠癌细胞凋亡的作用不受K-Ra。第11,12号外显子是否突变的影响。本实验中选用的HCT116细胞恶性程度较高，且具有K-Ras突变，而锉来磷酸在适当的作用浓度下仍可通过线粒体途径诱导其凋亡，提示临床工作中即使患者有K-Ras基因的突变，哩来麟酸仍能可能发挥一定的治疗作用。使用适当剂量和剂型的哩来嶙酸将是对于K-Ras突变的结肠癌患者治疗手段的有益补充。　　参考文献　　Metzger B,Chambeau L,Begon DY. 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