质谱技术在肺癌中的应用研究进展

肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤，每年确诊的肺癌患者约161万例，占恶性肿瘤的12.7%;肺癌相关死亡约138万例，占癌症相关死亡的18.2%。我国每年约40万患者死于肺癌，降低其病死率的关键在于早期诊断。然而，潜在癌变的细胞克隆远远小于现今测量技术可达的最小I=值，因此寻找一种比传统的影像学、组织学或细胞学方法更早诊断肺癌并有助于指导个体化治疗的技术手段已为众多医学者所期待。肿瘤蛋白质组学是蛋白质组学的重要分支，它从新的角度研究肿瘤，寻找肿瘤标志蛋白，进而阐明其表达水平的变化与肿瘤发生、发展的相互关系，对肿瘤的早期诊断、治疗、药物研发等具有重要意义。而质谱分析是蛋白质鉴定的核心技术，应用质谱技术研究肺癌已为众多学者所关注本文对近几年质谱技术在肺癌蛋白组学领域的应用研究进展综述如下。一、质谱分析方法蛋白质组学领域应用较多的质谱有电喷雾电离质谱ESI-MS、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、表面加强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)、傅立叶变换质谱(FTMS)等。基本工作原理:标本在离子发生装置内离子化，在分析装置内根据质量电荷比差异来分离，经检测装置中电子放大器测定，最后用位置、强弱不同的峰直观地表现出来，进而形成图谱用于分析。其中混合型傅立叶质谱具有超高的灵敏度和分辨率以及强大的测序功能，不但能够直接测定蛋白质的序列以鉴定蛋白质，还可以提供翻译后修饰及氨基酸突变等丰富的信息。二、质谱技术在肺癌中的应用研究呼吸道肿瘤较其他肿瘤有更丰富的被检标本，近年来许多学者积极尝试运用质谱技术从蛋白质水平研究肺癌。以下分别阐述组织、血清、胸水、痰液、呼出气等标本在质谱检测中的优缺点及在诊断、治疗、预后等方面的研究应用情况。1.组织标本:相对于其他标本，肺癌组织标本的优点在于其肿瘤相关蛋白含量高、成分相对单一、个体变异较少，且不受血浆高丰度蛋白质干扰，是一种较理想的检测对象。但大部分肺癌患者早期发病隐匿，因此组织标本相对于血液及痰液标本来说早期确诊优势不明显。缺点是取材相对困难、有创、不能实时进行标本获取，并且组织标本异质性大、可能混有坏死、炎性组织等其他成分，因此在进行质谱分析前，常需运用各种分级分离方法来提高组织标本纯度，以增加应用癌组织研究的优势。Au等，飞采用SELDI-TOF-MS对29例肺腺癌组织及其配对的癌旁正常组织进行蛋白质指纹图谱检测，结果在非吸烟女性肿瘤组织与其配对癌旁正常组织间筛选出52个有明显表达差异的标志蛋白，并在非吸烟患者与吸烟患者肿瘤组织间筛选出84个，在女性患者与男性患者肿瘤组织间筛选出69个，研究发现相对分子质量为54I66的标志蛋白在吸烟或性别相关标志分子的研究结果中同时出现，提示其可能为非吸烟女性肺腺癌的特异性肿瘤标志物，证明通过质谱分析可以发现肿瘤与正常组织及患者不同亚群之间的差异蛋白，且某些特殊标志蛋白可能具有重要的临床诊断意义刘桂芝和吴逸明“采用Western免疫印迹技术，筛选出抑癌基因Ras相关结构域家族1A基因(RASSFIA)表达和表达沉默的早期肺腺癌组织各5例，采用双向凝胶电泳(2-DE)技术建立两类不同早期肺腺癌组织蛋白质的2-DE图谱，筛选出9个存在明显表达差异的蛋白质点进行MALDI-TOF-MS分析，从中鉴定出5种存在明显表达差异的蛋白质，分别是细胞色素b5,605磷酸核糖体蛋白P2,碳酸醉酶1,5-毗咯琳梭酸还原酶I和载脂蛋白A-I前体蛋白。该结果不仅为进一步研究RASSFlA作用的信号转导途径奠定了初步的基础，并提示我们不同组织间的确存在大量可待研究发现的特定蛋白，若能通过质谱技术将众多差异蛋白联合检测，对肿瘤早诊率的提高将有极大帮助。邓瑰等〔s筛选26例有淋巴结转移的肺鳞癌患者人组，采用激光捕获显微切割技术及2-DE技术建立了纯化的肺鳞癌原发灶肿瘤细胞和匹配的淋巴结转移灶肿瘤细胞的2-DE图谱，MALDI-TOF-MS鉴定了22个差异蛋白质，与原发性肿瘤细胞相比，8个蛋白质在淋巴转移灶中的表达明显增高。该研究为筛选肺鳞癌转移标志物提供了前期基础，并提示我们对于影像学难以评估转移情况的肺癌患者，质谱分析可能对转移的判断有所帮助。2.血液标本:肺癌属于全身系统疾病，患者血液中很可能存在大量的、有潜在诊断价值的小分子多肤或自身抗体等疾病分子信息。选取外周血作为检测标本具有以下优势:(1）获取容易、无创;(2)标本预处理操作相对简单;(3)保存方便;(4)可在不同病期随时获取标本。对于血液标本的质谱分析，血液的收集和处理过程(凝集管、冻融次数、存放时间、温度等)、芯片类型、抗凝剂种类均是影响小相对分子质量蛋白组检测结果的主要因素困，因而特别强调标准化间题。由于血液中蛋白质成分复杂，高丰度的蛋白占据了大部分，给分析带来了一定的困难，但近年来发展的蛋白芯片、磁珠分离等技术给我们大规模分析外周血蛋白提供了方便。首先抽取患者血清，与蛋白芯片或磁珠结合，进行血清分离;其次将特异性结合的蛋白或多肤进行质谱分析，得到质谱图谱，然后用生物信息学统计工具进行分析;最后得到的差异蛋白可作为肿瘤标记物对癌症进行早期诊断。Zeng等采用高效液相色谱一串联质谱法对54例非小细胞肺癌(NSCLC)患者及160例对照组血清进行分析，找出了49个丰度存在明显差异的候选蛋白，确定了一套具有统计学意义的跨差丰富的NSCLC候选血清标志物。Liu等对227例肺癌患者血清进行SELDI-TOF-MS检测，发现联合血清样淀粉酶A和转甲状腺素样蛋白能够很好地确诊肺癌，阳性率可达91.6%。Song等通过基于磁珠分离的SELDI-TOF-MS分析30例肺癌患者、30例肺结核患者、33名健康者的血清标本，鉴定出17个差异有统计学意义的蛋白波峰。由其中4个峰建立的诊断模型区分肺癌患者与非癌症患者的敏感性为93.3%，特异性90.5%。诊断模型在盲样验证中灵敏度为75.0%，特异性为95%。数据库检索和文献查阅显示，这4个峰分别代表伴侣(M9725)、血红蛋白p亚基(M15335),血清淀粉样蛋白A(M11548)和一个未知的蛋白质。Hocker等“~采用ESI-MS对43例早期NSCLC患者和21例对照者的血清标本进行分析，鉴定的差异蛋白在预测价值方面区分患者及健康者血清的总体有效率和灵敏度为80%和84%a,有助于将早期NSCLC患者与对照组区分开来肿瘤的治疗过程中难免会出现耐药情况，如果可以预先判断耐药发生，则能够给疗效判断和及时更换治疗方案带来极大益处且新的疾病状态生物标志物的发现，有助于加深对疾病发生发展过程的理解，找到更多的药物靶标。杨学宁等「川收集了9例晚期NSCLC患者接受吉非替尼治疗前及疾病进展前2周的自身配对血清标本共20份。所有标本用弱阳离子磁珠进行预分离后，在MALDI-TOF-MS上进行血清蛋白质谱检测。通过自身配对分析发现有7个血清蛋白质表达水平在肺癌患者耐药前后的而清中差异有统计学意义提示这些差异蛋白可能是酪氨酸激酶抑制剂治疗后出现耐药的血清预测因子。Lazzari等〔12运用MALDI-TOF-MS建立一种名为VeriStrat的分类方法，这种方法使用一套八个预先定义的质谱峰将血浆标本划分为“好”和“坏”两组。多因素分析111例接受吉非替尼治疗NSCLC患者的不同时期的血浆标本，证实分人“好”组的患者有着更长的无进展生存时间和总生存时间，且“好”组与腺癌组织类型和功能状态评分相关。更重要的是，已知的表皮生长因子受体(EGFR)状态和基线时VeriStrat分类没有相关性。其初步的数据公布在第13届世界肺癌会议上，提出VeriStrat“坏”组患者化疗比吉非替尼治疗有更长的总生存时间，“好”组化疗和吉非替尼治疗的生存率差异无统计学意义。总的来说，这些数据提示当靶向治疗时“坏”组患者比“好”组临床疗效差，然而化疗也许可以提高“坏”组的生存率。这对于无法确认EGFR状态及EGFR野生型的患者尤为重要。3.痰液标本:痰液标本取材方法简单、无创、可重复性强，痰液里含有相对丰富的病理生理信息。但标本质量较易受咳痰方式影响。通过研究痰液可以发现肺癌相关的肿瘤标志物，特别是鳞癌。有研究报道肺癌痰检测的敏感性达65%。Palmisan等发现肺鳞癌患者在临床检出前3年就可以在痰液中发现抗癌基因pl6和06一甲基鸟嚷吟DNA甲基转移酶启动子区的异常甲基化现象。另外，在所有的肺癌类型患者的痰中发现甲基化诱导静止基因蛋白表达降低，痰液中甲基化诱导静止基因的超甲基化现象在晚期肺癌患者中普遍存在。这些研究提示通过在痰中检测基因的甲基化情况对于早期发现肺癌有重要意义。魏益平等在不对痰液进行任何预处理前提下，采用自主研发的中性解吸电喷雾萃取电离质谱技术对6例NSCLC患者和6例非肺癌患者的痰液样品进行快速质谱分析，发现两组患者的痰液指纹谱存在7处相对丰度有较明显差异的质谱峰，其中362耐z与367耐z之间的相对丰度差异最为明显，利用主成分分析法能够较好地将NSCLC组和对照组区分。该研究与既往不同之处在于待检痰液未经任何预处理，若能成功应用于临床实践，将成为肺癌的早期、无创、快速诊断及治疗随访期间的实时监测的较为理想的方法。4.胸水标本:胸水含有病灶组织分泌、脱落或漏出而沉积在局部的蛋白质或多肤，理论上是一种较好的生物标志物研究材料。但该方面的研究相对较少，可能与肺癌患者胸水成因多样化、胸水中所含肿瘤信息比例不一、标本保存相对困难等因素有关。石琴等采用sELDI一TOF一Ms技术探寻恶性胸水蛋白标志物，收集恶性和非恶性胸水各50份.按照年龄、性别进行配对，采用磁珠技术对血清蛋白进行捕获用蛋白质谱阅读器PBSll对芯片进行扫描、分析结果恶性和非恶性的胸水蛋白图谱相比，存在5个差异表达蛋日，其中包括3个高表达蛋白，为恶性胸腔积液的早期诊断提供了一种新的实验方法。Tyan等利用Esl一Ms对43例肺腺癌患者胸水研究，共检出1415种蛋白，其中某些蛋白未在血浆中检出，可能为胸水所特有。5.呼出气体标本:呼出气体是比所有其他标本更易获得的标本，在这种标本中寻找肺癌标志物是一项新的有益探索。宋耕等用Tedlaf采样袋收集正常人和I期肺癌患者呼出气体标本各10份，经固相微萃取浓缩后上样气相色谱/质谱进行定量检测，结果在呼出气体标本中可检测出74和114种挥发性有机化合物，其中24种化合物在所有标本中都被稳定检测并进行定量。在10份肺癌患者呼出气体标本中，正丁醇及3一轻基一2一丁酮的浓度均明显高于对照组，提示正丁醇和3一择基一2一丁酮可能是鉴别早期肺癌有效的肿瘤标志物。Rudnicka等采用固相微萃取和气相色谱一飞行时闯质谱对23例肺癌、30名健康者呼出气进行检测，发现呼出气体中的丙烷、二硫化碳,2一丙烯醛、乙苯和异丙醇这五种有机化合物可能将患者和健康对照组区分开来。类似的报道均提示呼出气体中一些由挥发性有机化合物构成的标志物有可能区分肺癌患者与正常受检者。但该领域总体仍处于初级阶段，检测装置改进、结果判读以及检测价格调整，将会是此检测应用于临床的研究方向。三、结语质谱是一种高通量检测仪器，可以对标本中所有的蛋白或多肤进行检测和质量测定，的确能够从标本中找到其他检测方法可能发现不到的特定相对分子质量的物质。就检测标本而言，组织标本成分相对单一但取材困难，血液标本容易获取但成分复杂，痰液标本取材简单但标本成分受多因素影响，胸水标本多含有肿瘤信息但信息比例不一，呼出气体最易获取但技术手段尚处于探索阶段。就现有研究而言，也存在一些问题:(l}标本成分复杂，检测过程中需去除大量的干扰蛋白质，同时尽量保留有意义的低丰度蛋白，因此相关技术有待进一步提高;(2}目前许多关于质谱的研究仅局限于发现有统计学意义的差异蛋白峰，列举出相对分子质量大小，或者比对数据库找出已知的蛋白名称，但如何分析那些检测出的未知蛋白，回归于临床应用还需要大量的后续工作，更深一步的转化研究函待进行但相信，随着质谱仪器的更新换代和技术的不断发展，今后不仅可以发现更多的肿瘤相关蛋白，还可以进一步了解它们的结构和功能，为肿瘤的深化研究创造条件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