鱼藤素对人食管癌Ec-109细胞增殖及凋亡影响的实验研究

鱼藤素(Deguelin)是除鱼藤酮之外鱼藤属植物中最常见的鱼藤酮类化合物，分子式为C'23H22 O6，分子量为394. 4。其存在于毒灰叶、鱼藤和毕澄茄的根中，以及浮氏灰叶的叶中，是一种存在于多种植物中的黄酮类化合物。最近的研究表明，鱼藤素具有抗病毒、抗肿瘤作用，是一种具有潜在临床应用价值的抗癌新药[1,2]，而目前国内外对其抗肿瘤机制的研究还不深 人，尤其未见其对食管癌的作用和相关机制研究。本实验以不同浓度鱼藤素处理人食管癌Ec-109细胞，分别通过CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖及凋亡情况，探讨鱼藤素对食管癌细胞的作用机制。

材料与方法

1细胞人食管癌细胞株Ec-109购自中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所，河北北方学院实验中心冻存保留。

2药物、试剂及仪器鱼藤素购自瑞士ALEXIS 公司(ALX-350 -118-M025 )，纯度为95.6，用二甲基亚矾(DMSO)溶解配成10 mmol/L的储存液，等量分装，一20℃保存，使用前用RPMI 1640稀释成各种浓度。RPMI 1640培养基(11875 -101)为美国GIB- CO公司产品;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;细胞计数试剂盒一8 ( CCK-8 )购自上海玛芝佳公司;Annexin V/PI双染试剂盒(BMS1031为美国BD公司产品。流式细胞仪为美国BD公司(型号: FACS Aria)，透射电子显微镜(型号:H-7650)为日本日立公司产品，酶标仪(型号Stat Fax-2100)为美国 BD公司产品。

3细胞培养及分组将人食管癌细胞株Ec-109 细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基在含有 5%C02,37℃恒温培养箱中进行培养。细胞生长进人对数生长期后，用0. 25胰蛋白酶( Trypsin消化细胞，细胞计数后进行传代培养，待细胞贴壁后，将细胞分为5组:空白对照组(即加人与实验组等量的培养液)及5 ,10 ,20 ,40 nmol/L鱼藤素组。

4 CCK-8法检测细胞增殖抑制采用CCK-8 法，每组设4个复孔，按上述分组方法分别作用24 , 48 ,72 h后，选择490 nm波长，在全自动荧光酶标仪上检测各孔的吸光度(OD)值。通过下列公式计算各组细胞生长抑制率:生长抑制率(%)=(实验组OD4so 值一对照组OD4s。值)/对一照组ODQs。值x 100%。

5透射电镜观察细胞凋亡情况将不同浓度鱼藤素作用24 h的Ec-109细胞1x106个，离心，弃上清;分别用2. 5%的戊二醛和1%饿酸固定细胞，PBS 缓冲液充分洗涤;梯度丙酮脱水，浸透、包埋与聚合，超薄切片并进行醋酸双氧铀、构椽酸铅双染色，观察各组细胞器的超微结构变化。

6流式细胞仪检测细胞早期凋亡收集不同浓度鱼藤素作用24 h的Ec-109细胞，每组计数1 x 106 个细胞，离心，弃上清液，用PBS缓冲液洗涤2遍，再按照流式试剂盒的说明向细胞中分别加人185uL缓 冲液，5 uL Annexin V和10uL PI,混匀避光 20 min，离心后弃上清，再加人冷PBS洗涤，次，用 500uL PBS缓冲液悬起细胞，采用流式细胞仪进行细胞早期凋亡检测。

7流式细胞仪检测B c1-2和Bax蛋白表达不同浓度鱼藤素作用Ec-109细胞2东48 h后，经消化、磷酸盐缓冲液洗涤、离心3次。各组均分别加人 FI丁C-Bax抗体，00uL 及PE-Bcl-2抗体10uL 室温下避光温育30 min，再用PBS缓冲液离心洗涤2次，弃上清，用400uL PBS缓冲液悬起细胞，上流式细胞仪，检测各组细胞B ax和Bcl-2蛋白表达情况。 Bax ,Bcl-2蛋白表达的阳性判定标准均以对数方式采集数据，并以荧光指数(FI)表示基因蛋白的相对含量，公式为:FI=实验组蛋白表达的平均荧光强度树照组蛋白表达的平均荧光强度。FI>1,判定为表达水平升高，反之则为降低。

8统计学方法应用SPSS 16. 0统计软件进行数据处理，计量资料以X士S表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。 P < 0. 05为差异有统计学意义。

结果

1各组细胞生长抑制率比较(表1)与空白对照组同期比较，5,10,20,40 nmol/L鱼藤素组生长抑制率在24,48,72 h均增加，差异有统计学意义 (P <0. 05)，且20,40 nmol/L鱼藤素组生长抑制率明显高于同期10 nmol/L鱼藤素组p< 0. 05。随着千预时间延长，10,20,40 nmol/L鱼藤素组生长抑制率亦逐渐增加。

2各组细胞透射电镜下形态学比较(图1)空白对照组Ec-109细胞周边可伸出大小不等的微绒毛，细胞质中有丰富的游离核糖体，可见线粒体，内质网，溶酶体等细胞器。5 nmol/L鱼藤素组Ec-109细胞体积变小，出现明显凋亡结构，主要表现为异染色质 增多，染色质浓缩成团块，边集在核膜下，呈现新月形，细胞器数量减少;而40 nmol/L鱼藤素组Ec-109细胞溶酶体增多，内质网扩张，胞质水肿，出现空泡，逐渐形成凋亡小体，部分可见核碎裂。

3各组细胞早期调亡率比较(图2)鱼藤索对 Ec-109细胞有明显的诱导细胞凋亡和促进细胞死亡作用，5,10,20,40 nmol/L鱼藤素组细胞早期凋亡率分别为(4. 37士0.35)%, X6.71士0.14)%, (15. 62士0. 21 )%及(19. 78士0.15)%，与空白对照组自发早期凋亡率[(1.10士0.08)%」比较，差异均有统计学意义(P < 0. 05 )。其中以40 nmol/L鱼藤素作用更明显。

4各组细胞凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达比较(表 2)与空白对照组同期比较，10 ,20 ,40 nmol/L鱼藤素组Bcl-2蛋白F1值明显降低，而Bax蛋白FI值明显升高，差异均有统计学意义(P < 0. 05 )，且20, 40 nmol/L鱼藤素较10 nmol/L鱼藤素作用明显(P< 0. 05 )。与本组干预24 h比较，48 h时40 nmol/L鱼藤素组Bcl一蛋白FI值明显降低，20,40 nmol/L鱼藤素组日ax蛋白FI值明显升高，差异均有统计学意义(P<0. 01 ,P<0. 05)。

讨论

食管癌是我国较多见的消化系统恶性肿瘤之一，由于其起病隐匿，患者自觉症状不明显，确诊时多数已属中晚期，许多患者已失去手术及放疗的机会，而以化疗为主要治疗手段，但效果欠佳，病情不稳定，故新抗癌药物的开发迫在眉睫。 中药的细胞毒作用通常明显低于化疗药物，因此应将研究的目标立足于中药逆转肿瘤细胞增殖、分化、凋亡等生物学行为异常。近年来从天然动植物体内寻找敏感且无毒副反应的抗癌活性成分已成为国内外学者研究的热点之一。鱼藤素从植物鱼藤中提取，国内外学者对其生物学活性研究较少。国外有报道通过基因芯片分析评估鱼藤素作用于4个人类乳腺癌细胞系来探索其抗肿瘤的机制，结果显示鱼藤素通过 Wnt或其他信号传导通路来抗乳腺癌细胞增殖，为临床上评估鱼藤素对乳腺癌的治疗效果做出理论依据。另外由于常规化疗效果不佳，导致许多白血病患者预后差，故有研究显示鱼藤素可通过不同途径抑制白血病细胞增殖，并诱导其发生凋亡。

本实验结果发现，鱼藤素能明显抑制食管癌Ec-109细胞增殖，其抑制作用与药物作用时间和药物浓度正相关，呈时间一剂量依赖性，这与文献[7]报道的药物浓度范围一致。 为了更好地了解细胞凋亡的形态学特点，笔者还通过透射电镜观察发现40 nmol/L鱼藤素组Ec-109 细胞溶酶体增多，内质网扩张，胞质水肿，出现空泡，逐渐形成凋亡小体，部分可见核碎裂。而流式细胞仪检测到凋亡峰进一步了证实凋亡的存在。由此认为鱼藤素可诱导Ec-109细胞凋亡，且细胞凋亡的形态学改变明显。 Bcl-2蛋白表达于线粒体膜上，其主要作用是增强线粒体膜电位，维持线粒体膜的完整性，从而抑制线粒体释放促凋亡蛋白。此外，Bcl-2蛋白还可以抑制线粒体钙离子的释放[8]，使核酸内切酶无法活化，从而抑制细胞凋亡而延长细胞的寿命。有研究表明Bcl-2蛋白还具有直接抗氧化作用，可以抑制促凋亡蛋白Bax , Bak的细胞毒作用，抑制凋亡蛋白酶的激活[9]。 Bax0 蛋白在正常细胞中主要定位表达于细胞浆，在细胞受到死亡信号刺激后，发生构像变化，从细胞浆转移到细胞器膜上，尤其是线粒体外膜上，与抗凋亡蛋白Bcl-2形成异源二聚体，拮抗Bcl-2，使Bcl-22丧失对凋亡的抑制作用，引起细胞器功能丧失和各种促凋亡因子的释放，最终导致细胞的凋亡，故Bcl-2和Bax之间的平衡对细胞凋亡的调节起重要作用。

本实验结果发现，不同浓度鱼藤素作用下的Ec-109细胞中抗凋亡的Bcl-2蛋白表达均明显下降，并呈时间依赖性;而促进凋亡的 Bax蛋白表达却稳步升高，由此可见鱼藤素通过某些途径激活了促进食管癌细胞凋亡的基因，同时也能够下调抑制凋亡的基因，使食管癌细胞内Bcl-2与Bax蛋白表达比例降低，最终导致细胞凋亡。 总之，本实验结果显示鱼藤素可有效抑制Ec-109 细胞增殖，诱导Ec-109细胞凋亡，其作用机制与调节凋亡的相关蛋白表达有关，为临床上抗癌药物的进一步开发提供实验依据。

参考文献

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