肾透明细胞癌细胞系中NOTCH1调控PTEN／PI3K／AKT信号通路促进肿瘤进展

目前全球肾癌的发病率大约为每年150000人,死亡约78∞0人⑴,其中肾透明细胞癌约占肾癌的80%。尽管目前在肾癌发病机制的分子生物学方面的研究取得很大进步,但是肾切除仍然是治疗肾肿瘤的主要方法。对于转移性肾癌及晚期肿瘤,虽然靶向治疗可以延长患者生存期,但治疗效果非常有限。NOTCH信号通路参与多种组织细胞的生长、分化及凋亡调节,并在细胞的分化方向上发挥重要作用。越来越多的研究证实N()TCH信号通路的异常活化是肿瘤形成机制之一,例如黑色素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、宫颈癌等。PI3K/AKT信号通路是研究较为成熟的信号通路,在肿瘤发生中有重要作用,包括肾肿瘤的发生。

PTEN是PI3K/AKT信号通路的主要抑制因子,PTEN功能的缺失与肾透明细胞癌的进展和预后密切相关。我们前期试验研究已证实肾透明细胞癌组织中N,TCH1呈过度活化状态,本实验在肾透明细胞癌细胞系Cak及人肾近球小管上皮细胞系HKC中通过沉默NC)TCH1,观察它对HES1、PTEN和AKT(少8.473)基因及蛋白的影响以及对细胞周期、增殖、凋亡以及肿瘤细胞侵袭和迁徙的影响,探讨NC)TCH1在肾透明细胞癌细胞系中的功能以及它对PTEN/PI3K/ΛKT信号通路的作用。

1材料与方法

1.1材料肾透明细胞癌细胞系Ca2和人肾近球小管上皮细胞系HKC购自协和医科大学基础医学细胞中心,含10%胎牛血清的DMEM培养基(Gib co.UsA)培养细胞,培养箱条件:37C,5%CO2。

1.2方法

Qrt-PCR检测mRNA:RNA提取试剂盒(艾德莱生物公司,北京)提取细胞总RNA,一步法逆转为cDNA。SYBR Grccn做荧光定量PCR,ct法分析数据,内参采用PPIA。引物序列见表1。每个标本做3个复孔.重复3次。Western blot检测蛋白:RIPA裂解液(萦莱宝生物公司,北京)提取细胞蛋白,BCA(艾德莱生物公司,北京)法检测蛋白浓度,每泳道上样量30~5。ug,10%SDS PAGE胶电泳.电转移蛋白至PVDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭2h,孵育一抗4 C过夜,洗膜,孵育二抗室温1h,洗膜后ECI'(普利莱生物公司,北京)发光检查。NoTCH1、PT EN、HES1、AKT一抗购自美国abcam生物公司,GAPDH及辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国santa crtlz生物公司。

siRNA的细胞转染:转染前24h细胞接种于6孔板,转染试剂为Lipofectamine⒛0o(1nvitro gen).按试剂说明书操作,siRNA由上海吉玛生物公司设计并合成,序列如下:阴性对照(SENSE:5’—UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3’;ANTI SENSE:5’ACGUGACACGUUCGGAGAATT_3’),NOTCH-1 siRNA(sENSE:5’GUCCG_GΛAACAACUGCAATT3’;ANTI SENSE:5’UUGCAGUUGUUUCCUGGACTT3’),HES1 siRNA(SENSE:5CCACGUGCGAGGGCGUUAA TT-3';ANTI SENsE:5UUAACGCCCUCG-CACGUGC)TT3')。转染后24h及48h分别提取mRNA或蛋白。

细胞增殖实验:转染前24h细胞接种于6孔板,转染后24h细胞再次接种于96孔板,转染后72h每孔加MTS(the CdlTiter96ΛQueous Olc-Slution Reagcnt,Promega)20ul,培养箱孵育4h,酶标仪测490nm处吸光度。流式细胞仪检测细胞凋亡及周期:转染前24h约7.0×1o1细胞接种于6孔板,转染后24h收集细胞,PI染色后(碧云天生物公司)上机做细胞周期分析;Annexln V和PI双染后(Annexin V「ITC Apoptosis Detection Kit,碧云天生物公司)做细胞凋亡检测。每个实验做3复孔并重复3次。沉默NOTCH1或HES1对Cak2细胞的侵袭和迁徙能力影响:细胞转染N()TCH1或HES1后24h细胞再接种于Trans well小室,分别培养12h和6h,弃去孔中培液,PBS洗2遍,甲醇固定20min,0.1%结晶紫染色15~20min,用清水洗3遍以上,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,100倍显微镜下随即5个视野观察细胞,记数。

1.3统计学分析

数据以均数土标准差表示,采用SPSS11,0统计软件包.应用r检验进行统计分析。P(0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 NOTCH1信号通路和PTEN在Cak卜2和HKC细胞中的表达情况为了验证NOTCH1信号通路和PTEN基因在Cak←2和HKC细胞株中是否表达,我们用PCR检测NOTCH1、HES1和PTEN的mRNA,结果发现在2株细胞申均可检测到NOTCH1、HES1不口PTEN,并且NOTCH1、HES1在Caki2的表达高于HKC,Cak←2中的PTEN mRNA水平低于HKC(P<0,001,图1Λ)。结合组织及细胞检测结果,我们推测在肾透明细胞癌中N()TCH1可能调节PTEN,从而影响PI3Κ/AKT信号通路的活性.

 2.2沉默NOTCH1抑制细胞增殖,促进细胞周期阻滞,抑制肿瘤细胞的侵袭和迁徙MTS法检测显示沉默NoTCH1均可抑制两株细胞的增殖(P<O.05,表2)。两株细胞转染后24h annexin V/PI双染未发现沉默NC)TCH1可以诱导细胞凋亡,但细胞周期检测则发现明显差异,与阴性对照比较,Cak←2细胞的G。G1从45,8%提高到65.3%,HKC细胞的GO Gl从48,1%提高到64.3%(P<0.05,表3)。沉默NOTCH1可抑制Cak⒈2细胞的迁徙和侵袭能力(图2),侵袭细胞数:NoTCH1RNAi:(35.33±4.24)个/孑L,对照为:(74,83±5.40)个/孑L(P<0.001)。迁徙细胞数:NOTCH1RNAl:(37,80±3,52)个/孑L,对照为:(92,27±6.93)个/孑1(P<0,001)。沉默NOTCH1下游靶基因HEs1,亦可抑制Cak2细胞的迁徙和侵袭能力。侵袭细胞数:HEs1RNAi:55.87±6.25个/孑L,对照为:74.83±5.40个/孑L(P<0,001)。

迁徙细胞数:HES⒈RNAi:(45,9±4.72)个/孔,对照为:(92.27±6.93)个/孔(P<0.001)。

2.3沉默NOTCH1对PTEN/AKT信号通路的影响Cak卜2和HKC细胞转染siRNA沉默NOTCH1,Westem blot检测转染后48h细胞的NOTCH1蛋白以验证转染效率及特异性(图1B)。分别于转染后24h和48h检测细胞mRNA和蛋白变化,同阴性对照相比,2株细胞转染后均可见NOTCH1、HEs1的mRNA明显下降,而PTEN的mRNA升高(P<0.00,图1C)。蛋白检测发现NOTCH1、HES1和PTEN变化趋势同mRNA,AKT(p Ser473)蛋白在沉默NOTCH1后明显下降(图1B)。

2.4沉默HESl引起PTEN mRNA和蛋白表达上调分别于转染后24和48h检测细胞mRNA和蛋白变化,同阴性对照相比,2株细胞转染后均可见PTEN的mRNA升高(P<0.05,图3A)和蛋白表达升高。Cak←2和HKC细胞转染siRNA沉默HES1,Western blot检测转染后48h细胞的HES1蛋白以验证转染效率及特异性(图3B)。

3讨论

NOTCH信号通路在决定细胞分化方向,细胞增殖和凋亡过程中起重要作用。在不同组织起源的肿瘤中,NoTCH1信号通路的异常活化对细胞代谢、细胞周期抑制及血管生成起不同的功能,从而表现出促进或抑制肿瘤的作用。我们前期研究发现NOTCH1的mRNA在肾透明细胞癌中的表达水平明显高于相对应的非肿瘤肾组织,Westem blot检查也可见肿瘤组织中NOTCH1蛋白表达明显升高i。本实验在肾透明细胞癌细胞系Cak←2中发现NOTCH1信号通路的活性高于人肾近球小管上皮细胞系HKC,抑制NOTCH1信号通路可以抑制细胞增殖,影响细胞周期,抑制肿瘤细胞的侵袭和迁徙。有文献报道NOTCH1受体及其配体Jagged1在肾细胞癌的表到水平高于正常肾组织,并且抑制N(订CH1信号通路可以抑制原代肾细胞癌细胞的生长及种植瘤的生长。我们的研究结果与文献报道相一致,可以认为NoTCH1信号通路在肾透明细胞癌发生中起促进肿瘤形成作用。PI3K/AKT信号通路是目前研究较成熟的信号通路,它通过直接或间接作用促进肿瘤细胞生长,增加葡萄糖代谢及增强细胞存活能力,PI3K/AKT信号通路的异常活化普遍存在于人类肿瘤,包括卵巢癌、前列腺癌、肺癌和肾细胞癌,是重要的肿瘤促进囚素。

PTEN是PI3K/AKT信号通路的主要抑制因子,在一些恶性肿瘤中已经证实存在PTEN的遗传变异或缺失。尽管在肾细咆癌中PTEN基因的突变很少发现",但是肾细咆癌中PTEN的表达明显降低。另外,研究发现在胸腺细胞成熟过程中,N()TCH1信号的活化对维持AKT的活性和葡萄糖代谢中起重要作。HEs1是N()TCH1信号通路的下游靶标,受NOTCH1直接调控,发挥转录抑制作用。已有研究发现HES1可以和PTEN启动子结合,从而抑制PTEN蛋白的表达Ι。本实验中,为证实NOTCH1确实可以调节PTEN/AKT信号通路,我们在Cdki2及HKC细胞中转染阻断NOTCH1信号通路.检测其下游目标发现HES1基因及蛋白下降·AKT(p Ser姓73)蛋白下降,而PTEN基因和蛋白均较对照升高。进一步转染s卜RNA沉默NOTCH1下游基因HES1,引起PTEN蛋白及m RNA升高,由此可以证实此信号调节通路的存在。而NOTCH1信号通路在肾透明细胞癌中发挥的促癌作用极有可能是通过调节PTEN/PI3K/AKT信号通路来实现的。虽然一些靶向治疗可以延长患者生存时间矽口舒尼替尼或索拉非尼等,但目前对转移性肾透明细胞癌的治疗仍然缺乏有效手段。

我们的研究首次证实在肾透明细胞癌中NOTCH1可以调节PTEN/PI3K/AKT信号通路。越来越多的文献显示NOTCH信号通路异常活化在肿瘤发生中起重要作用,如乳腺癌、成神经管细胞瘤、肺癌、肠癌等,并且NOTCH信号通路阻断剂,如DAPT,已经应用于乳腺癌和成神经管细胞瘤的临床治疗.14d5〕。我们的研究结果将为肾透明细胞癌以NOTCH1和AKT作为靶向的治疗提供新的思路。