细胞DNA 定量检测在宫颈癌筛查中的应用

Feulgen染色是由Feulgen 和Rossenbeck[1]在1924 年提出的细胞核内DNA 染色技术，广泛应用于DNA 结构研究。目前Feulgen 染色主要用于细胞核内DNA 定量分析[23]。Feulgen染色操作步骤简单，主要由酸化和染色过程组成，但二者对染色效果的影响尚不明确。全自动DNA 倍体分析仪已广泛用于细胞DNA 定量检测，具有敏感性高、结果客观的优点。本文探讨了Feulgen染色在宫颈细胞DNA 定量检测中的作用及相关影响因素。

1　资料与方法1.1　一般资料　在本院进行宫颈癌筛查的妇女3162 例，年龄30～50岁。

1.2　仪器与试剂　宫颈癌普查试剂盒及细胞DNA 倍体分析仪(武汉兰丁)。

1.3　方法

1.3.1　标本制备及检测　以试剂盒说明书的要求采集受试对象宫颈刷片标本，每例标本制成2 张薄层细胞学片，1 张采用巴氏染色进行常规细胞学诊断(TBS诊断)，诊断意见包括：正常或良性、不明意义的非典型鳞状上皮(ASCUS)、低级别鳞状上皮内病变(LSIL)、高级别鳞状上皮内病变(HSIL)或原位癌(CIS)、鳞状上皮浸润癌。另1张采用Feulgen染色，常规染色(5mol/L HCl处理1h，硫堇染色1h，水洗、脱水及封片)后以DNA 倍体分析仪扫描染色片，每张染色片扫描细胞核超过5000个，分析99个特征值，包括形态特征、吸光特征、具体结构特征、Markovian和非Markovian结构特征、长度特征等，并根据不同细胞成分所具有的不同特征参数进行自动细胞分类和计数，如正常上皮细胞、增生或癌变细胞、淋巴细胞及未参与诊断的垃圾细胞(重叠细胞核、聚焦不良细胞核和核碎片等)[5]。对照细胞为同一染色片中的100个正常上皮细胞，以其平均光密度(IOD)为双倍体参考值。以下3 种情况判为异常：出现非整倍体细胞(如五倍体)、四倍体细胞数超过被测细胞总数的10%、出现非整倍体细胞峰。对五倍体细胞进行显微镜观察，并逐一进行核实，以排除分析仪将垃圾和重叠细胞核误认为癌细胞或异常细胞。结合TBS诊断意见及DNA 定量检测结果给出综合诊断及建议。国际检验医学杂志2013年1月第34卷第2期　IntJLabMed，January2013，Vol.34，No.2 ·199· 1.3.2　阴道镜及病理学检查　凡建议组织活检的妇女，均进行阴道镜检查并对可疑部位进行4点以上的组织活检。每例活检标本均进行病理学检查，给出病理诊断，包括正常、宫颈炎(CC)、宫颈上皮内瘤变(CIN1)、CIN2、CIN3 或原位癌、浸润癌。1.3.3　不同检测方法诊断结果比较　选择病理诊断为CIN2、CIN3/原位癌、浸润癌的12例患者，每例患者制备6张薄层细胞学片，用3种Feulgen染色法进行检测，比较3 种方法以下指标检测结果的差异，包括二倍体细胞IOD、平均上皮细胞数量(扫描10min)、五倍体细胞数量、出现五倍体及其以上多倍体细胞的患者例数、细胞核膜边缘和细胞核内纹理染色情况。

2　结　　果

3162例宫颈细胞标本常规细胞学及DNA 倍体检测结果见表1。32例患者进行宫颈病理活检，不同病理诊断患者常规细胞学及DNA 倍体检测结果见表2。12例CIN2、CIN3/原位癌、浸润癌患者宫颈细胞标本进行3 种Feulgen染色方法(见表3)检测，检测结果见表4。常规染色组二倍体细胞IOD 高于其他两种方法处理组;水解时间缩短组平均上皮细胞数量(扫描10min)少于其他两种方法处理组，而常规染色组和染色时间缩短组间无明显差异;常规染色组和染色时间缩短组平均异倍体细胞数无明显差异，但均多于水解时间缩短组;常规染色组细胞核边缘清楚、核内纹理清楚，染色时间缩短组核边缘和核内纹理减弱，水解时间缩短组细胞核膜边缘不清、核内纹理不清。

表1　　宫颈细胞常规细胞学与DNA倍体检测

正常2964 2833 120 11

ASCUS 144 96 29 19

LSIL 32 8 8 16

HSIL 22 1 3 18

合计3162 2938 160 64　　

 ：指五倍体及其以上多倍体细胞数量，下同。

表2　　不同宫颈组织病理诊断患者常规细胞学就DNA 倍体检测结果

CC 8 2 3 2 1 3 5

CIN1 9 1 3 3 2 2 7

CIN2 8 1 3 2 2 2 6CIN3 5 0 1 1 3 0 5

宫颈癌2 0 0 0 2 0 2

合计32 4 10 8 10 7 25

表3　　3种Feulgen染色方法染色方法

常规方法2 1 1

水解时间缩短2 0.5 1

染色时间缩短2 1 0.5

表4　　12例CIN2或CIN2以上级别宫颈病变

指标 正常染色 水解时间 缩短染色时间缩短

二倍体细胞IOD 230 170 202

平均上皮细胞数6731±1207 3393±1032 5432±1423

多倍体细胞数58±32 12±6 32±11

出现多倍体细胞的例数△ 12 5 10

细胞核膜边缘 清楚 模糊 一般

细胞核内纹理 清楚 不清 一般　　

△ ：多倍体细胞包括五倍体及其以上多倍体细胞。

3　讨　　论

Feulgen染色可证实细胞核内DNA 含量与染色质数量密切相关，相同组织细胞具有相同的核内DNA 含量，且细胞在有丝分裂前DNA 含量增大1 倍[68]。通过Feulgen染色可对细胞核内DNA 含量或倍体进行检测，从而判断细胞生理状态和病理改变，已广泛应用于科研和临床。本研究利用细胞DNA 倍体分析仪对3162例宫颈细胞Feulgen染色标本进行了检测，结果显示多数LSIL、HSIL 患者标本均可检出五倍体及其以上多倍体细胞，在15例CIN2、CIN3、宫颈癌患者中，13例可检出3个或3个以上五倍体及其以上多倍体细胞，而常规细胞学检测仅检出10 例LSIL、HSIL。国内外学者均报道DNA 定量检测对宫颈癌的诊断灵敏度高于常规细胞学检测[910]。宫颈癌前病变或宫颈癌可导致宫颈细胞DNA 含量异常，Feulgen染色加深，通过与标本中正常二倍体细胞比较，即可计算获得DNA 含量。因此，以Feulgen染色进行定量细胞学检测可用于肿瘤诊断。　　Feulgen染色主要包括水解和染色过程，主要是在酸性条件下使DNA 上的脱氧核苷酸与碱基分解，形成含有醛基结构的核苷酸，然后再与Schiff试剂反应而显色。然而DNA 分子在酸性水解过程中可被裂解成极易从细胞核中脱落的小片段。因此水解过程可出现两个相反的结果，如果水解引起醛基结构增多，可使染色强度增高而提高IOD，细胞核膜边缘和核内纹理清晰;如果水解引起较多DNA 片段脱落，则IOD 下降。本研究结果显示，缩短水解时间(0.5h)、保持正常染色时间可使IOD 下降，细胞核膜边缘及核纹理均不清晰，说明水解30 min可导致水解不充分，DNA 醛基形成量减少，染色后引起细胞核形态改变而导致出现异倍体细胞，进而引起误诊。染色时间也是影响Feulgen染色效果的关键因素。将染色时间缩短至0.5h后，细胞核内IOD、细胞数量等均下降，但与常规染色法相比并无显著改变。本研究中，12例高级别宫颈病变中，10例标本可检出五倍体及其以上多倍体细胞，而常规染色法在12例标本中均可检出，可能与染色时间缩短导致Schiff′s试剂与醛基结合不充分有关。总之，Feulgen染色在细胞核内DNA 定量检测中具有重要作用，可用于肿瘤的诊断;Feulgen染色水解及染色步骤是决定染色效果的关键步骤，DNA 倍体分析可用于宫颈细胞学检测。

参考文献

[1] Feulgen R，Rossenbeck H.Mikroskopichchemischer Nachwei

[2] 陈奎霖.结核抗体在诊断结核病中的意义[J].中国热带医学，2008，8(9)：1608.

[3] 张国庆，付玉军，田巧，等.斑点金免疫渗滤法检测结核分枝杆菌抗体在肺结核诊断中的应用[J].中国医药导报，2008，5(8)：8990.

[4] 胡忠义，靳安佳，宋月珍，等.四种结核抗体试剂盒临床应用评价[J].中国防痨杂志，1998，20(1)：3234.

[5] SinghM，AndersenAB，McCarthyJEG，etal.TheMycobacteriumtuberculosis38kDaantigen：overproductionin Escherichiacoli，purificationandcharacterization[J].Gene，1992，117(1)：5360.

[6] JackettPS，BothamleyGH，BatraHV，etal.Specificityofantibodiestoimmunodominantmycobacterialantigensinpulmonarytuberculosis[J].JClin Micorbiol，1988，26(11)：23132318.

[7] 陈红兵，张小刚，何秀云，等.结核分枝杆菌重组38KDa蛋白质抗原免疫学特性的研究[J].中国现代医学杂志，2005，15(6)：837839.

[8] SaidToihirAH，Richard V，RaharimangaV，etal.Evaluationofanimmunochromatographictestforthediagnosisofpulmonarytuberculosisin Madagascar[J].BMCResNotes，2011，4：403.

[9] LiX，XuH，JiangS，etal.TBSAantibodytestfordiagnosisandmonitoringtreatmentoutcomeofsputumsmearnegativepulmonarytuberculosispatients[J].SoutheastAsianJTropMedPublicHealth，2011，42(5)：11471153.

[10]高孟秋，初乃惠，王海英，等.结核分枝杆菌特异性蛋白抗体检测在结核病诊断中的价值[J].中华结核和呼吸杂志，2007，30(12)：918920.

[11]毕爱笑，徐德兴，胡忠义，等.TBSA 结核抗体检测的临床应用评价[J].同济大学学报：医学版，2008，29(2)：7784.

[12]孙伟民，任永变.肺结核误诊54 例原因分析[J].职业与健康，2001，17(11)：146147.

(收稿日期：20120918)