2种方法检测非小细胞肺癌EGFR 基因突变的比较

肺癌是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的80%以上，很多NSCLC 患者在确诊时已是肺癌晚期，具有较差的预后[1]。近年来，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFRTKI)类小分子靶向药物已进入NSCLC 患者的临床治疗并取得良好的疗效。许多研究表明[24]，EGFR 基因酪氨酸激酶功能区的体细胞基因突变与NSCLC 患者EGFRTKI靶向治疗敏感性密切相关，其中约90%的突变发生于19、21外显子上，EGFRTKI在突变患者中的有效率可达70%以上，而在非突变患者中有效率仅10% 左右。因此检测EGFR 基因19、21 外显子突变对于指导临床EGFRTKI对NSCLC 患者的靶向治疗具有重要意义。目前临床应用的检测EGFR 基因突变的方法主要为测序法和实时荧光PCR 法，其中实时荧光PCR 法又分为Taqman实时荧光PCR 法、特异引物双扩增荧光PCR 法等亚类，上述方法各有优缺点。本研究选择临床常用的测序法和Taqman实时荧光PCR 法检测60 例NSCLC 患者肿瘤组织EGFR 基因19、21外显子突变情况，并分析结果间的差异，旨在为临床选择合适的EGFR 基因突变检测方法提供实验依据。

1　资料与方法

1.1　一般资料　收集2011 年广州医学院附属肿瘤医院NSCLC 患者肿瘤组织样品60 例，其中石蜡切片样品42 例，75%乙醇固定组织样品18 例;男性37 例，女性23，年龄34～78岁，中位年龄58岁。

1.2　仪器与试剂　测序法、Taqman 实时荧光PCR 法检测EGFR 基因19、21外显子基因突变试剂盒分别购自北京鑫诺美迪科技有限公司、北京金菩嘉医疗科技有限公司，两法对应的检测仪器分别为美国ABI3130xl基因测序仪和ABI7500fast实时荧光定量PCR 仪。

1.3　方法

1.3.1　样品前处理　石蜡切片样品：取1.5mLEppendorf管1支，加入1mL 二甲苯。依据组织大小与肿瘤细胞含量取石蜡切片6～15片，每片滴加1～2滴二甲苯，取洁净手术刀片刮取玻片上组织放入Eppendorf管中，振荡混匀后静置10 min，12000×g离心5min，弃上清液。重复以上步骤用1mL 二甲苯洗涤样品1次，加入1mL 无水乙醇，12000×g离心5min，弃上清液。再使用无水乙醇重复洗涤样品1次。室温开盖静置，待无水乙醇彻底挥干。75% 乙醇固定组织样品：用洁净手术刀于送检肿瘤组织中做4～6 点取样放入Eppendorf管中，75%乙醇洗涤样品1次，弃上清液。室温开盖静置，待乙醇彻底挥干。

1.3.2　基因组DNA 提取　使用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒，按试剂盒说明书操作步骤提取基因组DNA，提取后测OD260、OD260/OD280评估DNA 含量与纯度。

1.3.3　DNA 测序突变检测　实验全程设置阴、阳性对照。依据试剂盒说明书，利用PCR 仪扩增EGFR 基因19、21外显子。扩增引物如下：19F5′CCTTAGGTGCGGCTCCACAGC3′，19R5′CAT TTA GGA TGT GGA GAT GAGC3′;21F5′CAG CCA TAA GTC CTC GAC GTG3′，21R 5′TCCTCCCCT GCA TGT GTT AAA C3′。PCR 反应条件为：94 ℃ 2min;94 ℃ 15s，55 ℃ 30s，72 ℃ 45s，45 个循环;72 ℃ 7min。取PCR 产物5μL 加入2μLSAP酶混合物混匀，37 ℃ 1h，80 ℃ 15min。酶解产物做双向测序反应，以PCR 上下游扩增引物分别作为正、反向测序引物。测序反应体系如下：PCR 酶解产物3μL、Bigdye3.1(美国ABI公司)1μL、测序引物2μL。反应条件为：预变性96 ℃ 1min;变性96 ℃ 10s、退火50℃ 5s、延伸60℃ 4min，25个循环;4℃恒温保存。测序反应产物加入醋酸钠乙醇溶液(3mol/L 醋酸钠∶无水乙醇=1∶15)16μL，剧烈振荡，避光静置15min，4℃ 12000×g离心30min，弃上清液。加70μL70% 预冷乙醇，温和颠倒混匀数次，4 ℃ 12000×g离心15 min，弃上清液。70% 预冷乙醇重复洗涤1次。室温开盖静置待乙醇挥发干净，加入10μL 高去离子甲酰胺后置PCR 仪上变性：95 ℃ 4 min，4 ℃ 4 min，上ABI3130xl测序仪测序。所得序列图采用Chromas2.23 软件通过与NCBI基因库标准序列比对，分析测序结果。

1.3.4　Taqman实时荧光PCR 突变检测　按试剂盒说明书配制双重荧光PCR 反应体系，19 外显子检测delE746A750、delL747P753insS两种突变类型，21 外显子检测L858R、L861Q两种突变类型，实验设置阴、阳性对照和空白对照。反应条件：50 ℃ 2min;95 ℃ 10min;95 ℃ 15s，62 ℃ 1min，40个循环。结果判读：首先空白对照、阴性对照无扩增曲线，阳性对照出现扩增曲线，实验有效。然后未出现扩增曲线或CT>38判断为阴性样品，出现扩增曲线且CT≤34 判断为阳性样品。

3　讨　　论

EGFR 基因位于人类染色体7p12，含28 个外显子，编码一种跨膜酪氨酸激酶受体，通过与相应配体结合调节细胞的生长、分化与增殖。EGFRTKI是一种抑制EGFR 酪氨酸激酶的小分子靶向抗肿瘤药物，其治疗敏感性与EGFR 基因18、19、20、21外显子突变状态密切相关，因此检测EGFR 基因突变对于指导临床EGFRTKI对NSCLC 患者的靶向治疗具有重要意义[5]。本研究选择了临床主要应用的检测EGFR 基因突变的测序法和Taqman实时荧光PCR 法，比较两法的检测性能差异。其中测序法是基因突变检测的金标准方法，可检测已知与未知突变，结果可靠、重复性好，但对样品要求较高、步骤多、耗时长[6]。Taqman实时荧光PCR 法步骤简单、耗时短，但只能检测已知突变位点与类型。本研究对测序法和Taqman 实时荧光PCR 法检测NSCLC 患者EGFR 基因19、21外显子的突变情况进行比较，两法结果符合率达到97.5%，差异无统计学意义(犘>0.05)，表明两法的检测性能接近，均可用于EGFR 基因突变检测。在两法检测19号外显子时，有2例结果不符，测序法检测为突变而Taqman实时荧光PCR 法检测为阴性。其原因为该2例样品19外显子突变类型超出了本研究选用的Taqman实时荧光PCR 法突变检测试剂盒的检测范围。实验中共发现19外显子的6 种突变类型，其中3 种超出了本研究选用的Taqman实时荧光PCR 法突变检测试剂盒的检测范围，同时发现1例样品正反向测序结果不一致，以上结果提示华南地区EGFR 基因19外显子突变位点多样、突变类型复杂，两种突变类型共存的情况实际存在。针对此类突变区域，Taqman实时荧光PCR 法只有增加针对不同突变类型的特异性突变检测探针的数量才能有效扩展突变检测覆盖范围，但对于未知突变仍会漏检。同时随着突变检测范围的扩展，实验的成本和复杂性快速增加，故针对此类区域更适合选用测序法检测突变。在两法检测21号外显子时，均只检测到L858R 突变，有1例样品Taqman实时荧光PCR 法检测为L858R 突变而测序法检测为野生型，可能为样品肿瘤细胞含量过低所致。测序法在实验过程中同时检测肿瘤细胞和正常细胞目的片段区域的DNA 序列信息，如样品的正常细胞比例过高，则肿瘤细胞的突变信号可能被掩盖，导致假阴性结果。故测序法对样品要求较高。以上结果表明，华南地区EGFR 基因21 外显子突变类型相对单一，两种突变检测方法均适用，Taqman实时荧光PCR法灵敏度略高。Sharma等[4]已报道EGFR 基因酪氨酸激酶功能区的39种突变类型，其18、19、20、21外显子突变构成比及突变类型数分别为5%、45%、5%、40% ～45% 和7 种、18 种、8 种、6 种。除以上39种突变类型外的新突变类型仍不时见于报道[79]。由此可见指导NSCLC 患者分子靶向治疗的EGFR 基因18～21外显子突变呈现突变位点和突变类型的多样性。其中21外显子突变位点与类型较单一可使用Taqman实时荧光PCR法检测，19外显子突变位点与类型较复杂，Taqman实时荧光PCR 法易漏检，宜选用测序法。同时18、20 外显子突变占总突变数的10%左右，临床应用时增加对18、20 外显子突变的检测可进一步提高EGFR 基因突变检测指导分子靶向治疗的有效性。相关研究显示[912]，EGFR 基因突变存在显著的地域、种群差异性，即使在中国不同地区也不尽相同，如EGFR 基因突变在台湾地区以21外显子为主、在吉林、广东、云南省以19外显子为主，而在北京、上海区两者间无明显差异。因此，同一检测方法在不同地区应用时可能会表现出不同的突变检出率;故临床选择EGFR 基因突变检测方法时，除了方法学性能外还应考虑当地的EGFR 基因突变分布特点。因本研究用于方法比对的样品数仍相对偏少，故接下来将进一步扩大比对样品数量以期获得更具代表性的结果。综上所述，在选择临床适宜的EGFR 基因突变检测方法时首先应了解当地的EGFR 基因突变分布情况，且检测范围应尽量涵盖18～21外显子。测序法与Taqman实时荧光PCR法均可用于EGFR 基因19、21 外显子突变的检测。与Taqman实时荧光PCR 法相比，测序法可同时、全面检测各种已知、未知突变，更适合指导临床靶向用药，但在具体检测时应注意合格标本的采集。在进行少数突变位点或突变类型检测时，实时荧光PCR 法则更能发挥其简单、快速、灵敏的特点。

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(收稿日期：20120711)