Livin蛋白在喉癌组织中表达及与喉癌细胞凋亡关系的研究

喉癌是头颈部常见恶性肿瘤,占头颈恶性肿瘤的3.3%~8.1%,占全身恶性肿瘤的1.2%~1.6%[1],鳞状细胞癌是其主要病理类型。恶性肿瘤的发生不仅与癌基因激活、抑癌基因失活导致的细胞增殖有关,而且与凋亡过程受阻引起的细胞凋亡减少有关,喉癌亦然。相关研究表明,细胞凋亡主要由凋亡抑制基因和凋亡活化基因共同调控,而二者调控平衡一旦被打破,肿瘤也就可能发生了。Livin是凋亡蛋白抑制因子(IAP)家族的一员,是抑制凋亡活性最强的因子[3]。目前Livin在喉癌组织中表达及与喉癌细胞凋亡的相关性研究较少,本研究采用免疫组化(SP)法检测Livin蛋白在喉鳞癌中的表达情况,同时用末端脱氧核苷酸轻移酶介导的荧光素标记dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测喉癌细胞凋亡并与免疫组化结果进行分析,旨在探讨Livin在喉癌发生、发展中的作用及其与细胞凋亡的相关性,为调控这些基因表达以及促进喉癌细胞凋亡的研究提供资料。

1 临床资料

1.1 一般资料 67例喉鳞癌组织及36例喉鳞癌相应癌旁组织(距离肿瘤切缘至少>12.5px[l])取自⒛04年9月-2011年9月于承德医学院附属医院耳鼻咽喉科住院手术67例原发喉鳞癌患者。术前均未接受放、化疗,标本为手术切除后1h内获得,标本获得后经10%甲醛固定、石蜡包埋、4um厚度连续切片。标本均经过病理学检查确诊。67例喉鳞癌患者中,男60例,女7例;年龄32~76岁,中位年龄58岁;采用国际抗癌协会(UICC)2010年公布的TNM分类分期标准I、Ⅱ期42例,Ⅲ、Ⅳ期25例。有淋巴结转移的18例,无淋巴结转移的翎例(有无淋巴结转移根据术后病理而定);声门上型21例,声门型46例;发病前吸烟史>20a(每日>20支)54例,≤20a13例;癌肿<75px 26例,≥75px41例;高分化(G1级)28例,中低分化(G2~G3级)39例。

1.2 试剂与仪器 一抗:兔抗人Livin单克隆抗体(武汉博士德BA1743)。二抗:辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体(中杉金桥ZB-2301),即用型DAB显色试剂盒(福州迈新生物),3%H2O2、4%中性甲醛、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇(100%,95%,90%,8O%,70%)、DAB工作液、苏木素或甲基绿、中性树胶等。原位末端标记试剂盒(德国宝灵曼)。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学SP法检测Livin蛋白表达每例标本解冻后经甲醛固定24h内行石蜡包埋,连续切取切片,进行Livin染色石蜡切片(5um),常规脱蜡至水,3%过氧化氢室温孵育10min,抗原修复15min,室温放置40min,PBS冲洗,小牛血清封闭10min,滴加一抗50uL(1:100工作液)4℃过夜,PBs冲洗,加二抗,室温孵育15min,PBs冲洗,DAB显色5 min,终止显色,蒸馏水冲洗,苏木素复染,透明,封片,镜检。

1.3.2 TUNEL检测喉癌细胞凋亡石蜡切片(5um),电热恒温箱8O℃烘烤5Omin,二甲苯脱蜡至水,用梯度乙醇(100%,95%,90%,8O%,70%)各浸洗1次,每次3min。PBS冲洗3次,每次5min,加细胞通透液8min,PBS漂洗2次,每次5mh,制备TUNEL反应混合液,处理组用50uL TdT+450uL荧光素标记的dUTP液混匀;阴性对照组仅加50uL荧光素标记的dUTP液,阳性对照组先加人100uL DNase 1,15~25℃反应10min,玻片干后,加50uL TUNEL反应混合液于标本上,PBS冲洗3次,每次5min,同时在荧光显微镜下观察计数凋亡细胞并拍照。玻片干后加50uLconverter-POD于标本上,加盖玻片在湿暗盒中37℃反应30min。PBS冲洗3次,每次5min,在组织液中加100uL DAB底物,2O℃反应10min。PBS冲洗3次,每次5min。苏木素复染后自来水冲洗。梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。光学显微镜下观察计数凋亡细胞并拍照。

1.4 结果判定

1.4.1 免疫组化结果判定 Livin主要表达于细胞浆或细胞核(多数在胞浆),以出现棕黄色颗粒为阳性反应。以PBS代替一抗作为阴性对照,以已知喉鳞癌阳性组织切片为阳性对照。采用Volm双评分法[4]进行判定在染色均匀的肿瘤区,选取5个高倍镜视野(×200):①按阳性细胞百分率(A值)评分,<25%为1分,25%~50%为2分,>50%为3分;②按染色强度(B值)评分,不着色为0分,浅棕黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。综合染色阳性细胞数(A值)与染色强度(B值)判断方法[2]:阴性(-)计0分,弱阳性(+)计1~2分,中度阳性(++)计3~4分,强阳性(料)计5~6分。

1.4.2 TUNEL结果判定 TUNEL染色结果在荧光显微镜下显示,TUNEL阳性信号为黄绿色或黄色荧光,位于胞核。TUNEL染色经DAB显色,结果判定标准以核为棕黄色判定为阳性。每例标本随机取10个高倍视野(×200),计数凋亡指数(AI),即1000个细胞中凋亡细胞所占百分比。

1.5 统计学处理 所有数据经Excel整理,应用SPSS13.0统计软件完成处理。计数资料采用x2检验。计量资料的实验数据以均数±标准差(X±s)表示,两样本均数比较用T检验。以P<0.05为有显著性差异,P<0.01为有非常显著性差异。采用Spearman等级相关分析方法分析Livin表达和AI的相关性。

2 结果

2.1 Livin蛋白表达情况 Livin蛋自在喉鳞癌组织、癌旁组织中均有表达。在喉鳞癌标本中Livin蛋白高表达,表达阳性率为67%;在癌旁组织中低表达,表达阳性率为8%。二者比较有显著性差异(P<0.O5)。见表1。

2.2  细胞凋亡情况 67例喉癌组织凋亡细胞高表达,AI为4.09±0.83;36例癌旁组织中凋亡细胞低表达,AI为24.26±1.01。二者比较有显著性差异(P<0.05)。

2.3  Livin表达与临床病理因素的关系 Livin蛋白的表达与喉鳞癌组织中的淋巴结转移、临床分期、分化程度有显著相关性(P均<0.05),与喉鳞癌组织中的肿瘤大小、吸烟量、年龄及性别无相关性(P均>0.O5)。见表2。

2.4 喉鳞癌组织细胞凋亡与Livin表达的相关性 经相关性分析显示,67例喉鳞癌组织中,Livin的表达与TUNEL阳性细胞数呈显著负相关(r=-0.415,P<0.O5)。

3 讨论

恶性肿瘤由于其生长快、无限制生长、局部浸润、侵犯、远处扩散转移、临床发现较晚等特性导致临床上难以完全治愈甚至死亡,而成为目前严重威胁人类身体健康的一类高发疾病。进人21世纪,肿瘤治疗进人综合时代,总治疗趋势是摒弃以前的超根治手术,采取规范化、个体化、循证医学的方法进行治疗。恶性肿瘤种类繁多,其发生、发展是一个多基因变异、多因素、多阶段累积的复杂病变过程,随着现代医学分子生物学飞速发展,研究发现人体正常细胞在多种因素的综合刺激下自身发生转化,出现无限制的迅速增殖从而形成恶性肿瘤。其主要原因就是由正常细胞的凋亡因素作用减弱以及其抑制凋亡因素作用的增强双方面共同引起的[5]。

异常增殖和永久化生长是恶性肿瘤细胞的生物学特点,本质上就是细胞凋亡不足决定的[6]。细胞凋亡的概念由Kerr等[7]于1972年正式提出,即机体细胞内部由某些基因控制的可以导致机体细胞生理性自主性的死亡过程。细胞凋亡是维持机体内环境稳定的重要因素之一,维持着细胞的新老更替,保持着机体的新陈代谢及各项机能能够得以正常运转。细胞凋亡参与恶性肿瘤的起始过程概括为3个阶段:信号传递、中央调控、结构改变。通过电镜和光镜等仪器对组织细胞进行细胞形态学微观观察,目前总结出检测细胞凋亡表达情况的方法主要有:测定染色体DNA ladder、脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)、流式细胞术等[8]。漫长生物进化过程中生物细胞凋亡建立了种类繁多的具有高度环境适应性和遗传保守性的精密复杂调控网络体系,并遵循着严密的自然科学规律,促使和/或阻滞细胞凋亡的各种凋亡相关蛋白以及进化上较为保守的级联反应等共同构成了这种网络体系。该体系主要受抑制凋亡因子和促进凋亡因子的共同调节产生一个动态的平衡从而使该体系维持动态稳定,是机体进行正常生理活动的基础,一旦内外界的不良因素影响到这个体系,使这个体系调控机制的出现失常,打破了“生老病死”的正常生理动态平衡,异常的细胞开始具有破坏性及扩散性的疯狂增殖,导致恶性肿瘤发生[9]。

Livin于2002年从人类cDNA文库中克隆发现。在人染色体中hvln基因位于20q13.3,总长度为4.6kb,Livin有一个羧基端环指结构域(RING结构域)和凋亡抑制蛋白重复序列(BIR)。研究发现恶性黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、胰腺癌和肺癌等组织中Livin高表达,而在人体正常组织中无或低表达[l0-15]。Livin这种特异性的表达现象使其成为目前肿瘤凋亡分子生物学研究的热点。Livin抑制细胞凋亡过程具体机制有:①通过抑制凋亡蛋白Caspase介导的凋亡途径的活性,阻断其级联反应,Livin是目前为止发现并证实的唯一能与促凋亡蛋白Caspase-3直接结合的蛋白,因其含有特殊B1R2功能区,Livin具有了与Caspasc-3直接结合的独特功能,从而直接抑制凋亡蛋白Caspase-3的凋亡活性;②Livin与多种途径诱导的细胞凋亡主要凋亡蛋自Caspasc-7、Caopaser-9等结合从而阻碍其他多途径的细胞凋亡的正常进行;③Livin激活并刺激TAK1/JNK1信号传导途径的抗凋亡作用。

喉癌发生的确切病因尚未完全明确,但相关喉癌基因表达水平变化及与细胞凋亡过程的相关性影响是其实质所在,寻找喉癌特异表达基因并阐明其功能成为目前研究热点。当细胞发生凋亡时会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组DNA断裂时暴露的3’-0H可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上荧光素标记的dUTP,从而可以通过荧光显微镜光学显微镜或流式细胞仪进行检测,这就是TUNEL法检测细胞凋亡的原理。它实际上是形态学和分子生物学相结合的方法,对完整的凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色不仅能准确地反应细胞凋亡最典型的形态特征和生物化学特征,还可检测出极少量的凋亡细胞,在这些不同方法中TUNEL法检测细胞凋亡灵敏度远比一般的形态学方法和DNA ladder测定法等要高。故在肿瘤临床及肿瘤细胞凋亡基础研究中采用较多。

本试验在喉鳞癌组织和癌旁组织组织中使用免疫组化SP法检测Livin的表达情况并与癌组织中虹进行相关性分析,结果显示在喉鳞癌组织中Livin的表达量及阳性表达率均明显高于癌旁组织,Livin的表达与凋亡细胞计数呈显著负相关。提示喉癌的发生可能与其组织细胞中LMn蛋白的高表达情况有关,同时考虑LMn抑制正常喉黏膜组织中Caspase介导的凋亡途径的活性,抑制正常喉黏膜细胞正常凋亡,产生过度的非正常增殖演变为喉癌细胞。宗志红等[16]发现在口腔正常黏膜组织及软组织囊肿中Livin蛋白的表达情况明显低于在口腔鳞癌组织中Livin蛋自的表达情况。Crnkovic-Mcrtens等[17]发现内源性Livin受到干扰后可有效地抑制宫颈癌Hela细胞生长,并发现癌细胞对如肿瘤坏死因子a、放射性物质、多柔比星等凋亡激活因素敏感性明显增加。在肺癌、胃肠癌、乳腺癌患者血清中检测到抗Livin抗体,而且在转移灶中发现带有Livin特异性的CD4+与CD8+T细胞浸润,这些现象从侧面提示Livin可能既参与恶性肿瘤生长、增殖过程,而且还可能参与诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答[3，18-19]。谢三祥等[20]发现唾液腺腺样囊性癌中Livin表达情况与癌组织病理类型、临床分期、淋巴结转移有密切关系,与患者性别、年龄、肿瘤部位及大小无关。这与本实验结果中Livin的表达与喉癌的淋巴结转移、分化程度、临床分期相关结果相同。而卓贤露等[21]发现喉鳞癌组织中Livin的阳性表达率显著高于正常组织,同时Livin表达量与淋巴结转移有关,未见与其他临床病理特征相关,这与本实验结果中Livin表达与喉癌的临床分期、分化程度相关的结果不同。提示因荷瘤器官的种类不同,Livin的表达情况也相应地存在差异。Livin的这种特异性表达特点使其可能成为喉癌治疗的预后判断的重要标志及潜在的生物学治疗靶点,使机体能够正常发挥清除恶性肿瘤细胞及活化的免疫细胞,为广大喉癌患者的明显有效综合性治疗带来曙光。

[参考文献]

[1]屠规益,唐平章.喉癌下咽癌现代理论与临床[M].济南:山东科学技术出版社,2002.19-117.

[2]Wang J.Roles of caspases in apoptosis,development,and cytokine maturation revealed by homozygous gene deficiencies[J].Journal of Cell Science,2000,(05):753-757.

[3]Yagihashi A,Asanuma K,Kobayashi D.Detection of autoantibodies to livin and survivin in Sera from lung cancer patients[J].Lung Cancer,2005,(48):217-221.

[4]Volm M,Koomage R,Mattern J.Prognostic value of vascular endothelial growth factor and its receptor Flt-1 in squamous cell lung cancer[J].International Journal of Cancer,1997,(01):64-68.

[5]Rust C,Lenardo MJ,Gores GJ.Apoptosis and liver disease[J].American Journal of Medicine,2000,(03):567-574.

[6]Susin SA,Zamami N,Lorenzo HK.Moleuclar characterization of Mitochondrial apoptosis inducing factor[J].Nature,1999,(6718):441-446.

[7]Kerr JFR,Currie AR,Wyllie AH.Apoptosis:A basic biological pheno-menon with wide-ranging implications in tissue kinetics[J].British Journal of Cancer,1972,(04):239-257.

[8]Yu KY,Ni J,Know B.A newly indentified member of tumor necrosis factor receptor superfaimly(TR6)suppresses LIGHT-mediated apoptosis[J].Journal of Biological Chemistry,1999,(20):13733-13736.

[9]Kobayashi K,Otaki M,Hatano M.Expression of a murine homo-logue of the inhibitor of apoptosis protein is related to cell proliferation[J].Proceedings of the National Academy of Sciences(USA),1999,(04):1457-1462.

[10]Lin JH,Deng G,Huang Q.KIAP,a novel member of the inhibitor of apoptosis protein family[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2000,(03):820-831.

[11]Grzybowska-Izydorezyk O,Smolewski P.The role of the inhibitorof apoptosis protein(IAP)family in hematological malignancies[J].Postepy Higieny Medycyny Doswiadczalne,2008.55-63.

[12]Tanabe H,Yagihashi A,Tsuji N.Expression of survivin mRNA and livin mRNA in non-small-cell lung cancer[J].Lung Cancer,2004,(03):299-304.

[13]Lopes RB,Gangeswaran R,McNeish IA.Expression of the IAP protein family is dysregulated in pancreatic cancer cells and is impportant for resistance to chemotherapy[J].International Journal of Cancer,2007,(11):2344-2352.

[14]Chang H,Schimmer AD.Livin/melanoma inhibitor of apoptosis protein as apotential therapeutic target for the treatment of malignancy[J].Molecular Cancer Therapeutics,2007,(01):24-30.

[15]Yagihashi A,Ohmura T,Asanuma K.Detection of autoantibodies to survivin mRNA and livin insera from patients with breast cancer[J].Clinica Chimica Acta,2005,(1/2):125-130.

[16]宗志红,尚德浩,孙长伏.Livin基因及其蛋白在人口腔鳞癌中的表达[J].上海口腔医学,2007,(03):315-318.

[17]Crnkovic-Mertens I,Semzow J,Hoppe-Seyler F.Isoformspecific silencing of the Livin gene by RNA interference defines Livin beta as key mediator of apoptosis inhibition in Hela cells[J].Journal of Molecular Medicine,2006,(03):232-240.

[18]Yagihashic A,Tsuji N,Lutter M.Detection of anti-livin antibody in gastrointestinal cancer patients[J].Clinica Chimica,2003,(07):1206-1209.

[19]Schmollinger JC,Hoar KM,Vonderheide RH.Melanoma inhibitor of apoptosis protein(ML-IAP)is a target for immune-mediated tumor destruction[J].Proceedings of the National Academy of Sciences(USA),2003,(06):3398-3403.

[20]谢三祥,朱声荣,陶学金.Livin和Caspase-3在唾液腺腺样囊性癌中的表达及意义[J].中国口腔颌面外科杂志,2009,(02):163-167.

[21]卓贤露,赵厚育,姜振东.凋亡抑制因子Livin在喉鳞状细胞癌中的表达与碱性成纤维细胞生长因子的关系[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2008,(03):114-116.