食管鳞癌中Livin及相关蛋白的表达及意义

食管癌是一种人类常见的消化道肿瘤,严重危害人类生命健康。我国食管癌的发病率居世界首位,也是本病病死率最高的国家。食管鳞癌的发生、发展是一个多步骤、多阶段、多途径、多因子的复杂渐进过程,其中原癌基因激活和抑癌基因失活导致肿瘤细胞增殖失衡和细胞凋亡,目前细胞凋亡与肿瘤的关系已受到普遍关注。本实验通过原位杂交方法和EliVisionTM免疫组织化学法检测凋亡抑制基因Livln、增殖核抗原Ki-67和Livin mRNA在食管鳞癌组织的表达情况,分析其食管鳞癌发生发展中的作用,旨在探讨其相关基因与食管鳞癌发生、发展的之间关系,为该疾病的早期诊断和预防提供科学的依据。

1 临床资料

1 一般资料 随机选取河北邯郸市中心医院于2006年1月-2011年12月存档的食管鳞癌患者78例为食管鳞癌组,男41例,女37例;年龄48~79岁,中位年龄64.6岁。请2位高年资病理医师按照WHO标准[1]对78例患者的切片进行复查。另选取同期食管疾病手术切取患者的食管上、下残端8例作为正常食管黏膜组。

1.2 试剂与方法 EliVisionTM试剂盒、二硝基联苯胺(DAB)显色液及Livin蛋白和Kl-67蛋白(北京中杉金桥生物技术有限公司)。采用微波EliVisionTM法,取已知切片作为阳性对照,以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.3 原位杂交染色 Livin mRNA原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。实验步骤:石蜡切片制作至常规脱蜡、进水,用3%双氧水室温处理10min,双蒸水水洗2次,充分暴露mRNA核酸片段,3%胃酸蛋白酶室温消化20min,0.5mol/LPBS洗3次,每次5min,然后水洗1次,放置于干的杂交盒中,每张切片加预杂交液20uL,42℃恒温箱3h,不洗,吸去多余液体,每张切片加杂交液20ul,专用盖玻片盖在切片上,42℃恒温箱过夜,37℃2SCC洗5min,37℃1SCC洗15min,加封闭液37℃30min,不洗,吸去多余液体,每张切片加生物素化鼠地高辛25℃30min,PBS洗涤45min,滴加过氧化物酶37℃20min,PBS洗涤45min,DAB显色,苏木素复染,水洗,脱水,透明,封片,采用预杂交液做阴性对照。

1.4 结果判断标准 Livin和Ki-67阳性定位于细胞浆和细胞核,Livin mRNA阳性信号分布于细胞浆,以各种抗体在细胞内出现棕黄色颗粒为阳性信号。参照Parenti等[2]的标准,每张切片均随机观察5个高倍视野(×400),阳性细胞数<5%为(-),5%~25%为(+),>25%~50%为(++),>50%为(+++)。(+)~(+++)均视为阳性表达,(-)视为阴性表达。

1.5 统计学处理 应用叩SPSS12.0统计软件处理。计数资料比较采用x2检验,相互关系检验用等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Livin、Ki-67和Livin mRNA在正常食管黏膜、食管鳞癌组织中的表达情况临床病理指标的关系见表1。

2.2 Livin、Ki-67和ERK-1mRNA在食管鳞癌组织中的相关性分析 Spearman相关分析显示,Livin和Livin mRNA,Lhin和Ki-67,Ki-67和Livin mRNA在食管鳞癌中表达呈显著正相关性。见表2~4。

3 讨论

我国是世界上食管癌高发地区,尤其以河南林县、河北磁县和涉县为高发区域,其病死率居恶性肿瘤死亡的第四位,严重危害人民生命健康,因此对食管癌的临床和基础研究有着重大意义。肿瘤的发生、发展与细胞的恶性增殖和细胞凋亡有着密切的关系,当今对细胞凋亡的研究是一个热点,Livin是新近发现的凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的新成员之一,人类Livin蛋自基因定位于20号染色体q13上,其中包括7个外显子和6个内含子,在肿瘤组织中常变现为特异性高表达[3]。Livin的抗凋亡活性的作用机制主要是:①首先通过抑制Caspasc途径实现,Livin可与Caspasc的活化形式(Caspase-3和Caspase-7)结合,抑制Caspase的活化达到抗细胞凋亡的作用。②Livin可以通过TAB1/TAK1途径激活JNK1,激活JNK1信号传导途径是Livin抗细胞凋亡作用的—条途径。③Livin也可以通过抑制DNA的损伤起到抗细胞凋亡的功能[4]。大量研究证实,Livin在肺癌[5]、胃癌[6]及肠癌[7]等组织中呈过度表达,并且在食管癌[8]组织中Livin mRNA和Livin蛋白的表达情况,也明显高于正常食管组织(P<0.05)。本研究结果显示,用Livin作为探针在肿瘤细胞检测,有能够准确的定位、增强特异性等特点,食管鳞癌组织中Livin蛋白和Livin mRNA阳性信号表达高于正常对照组织,提示Livin蛋白和Livin mRNA的过表达可能在食管鳞癌的恶性转化及其发生发展中起促进作用,与有无淋巴结转移、病理分期及分化程度密切相关(P均<0.05),提示LMn在胃癌的侵袭及不良预后中有重要作用。

Ki-67是一种与细胞增殖密切相关的核抗原,属于大分子蛋白,是临床上检测细胞增殖的重要检测指标,检测Ki-67可以判断肿瘤的进展、恶性程度等,具有重要的生物学意义,Ki-67在增殖细胞核中表达,在细胞静息期GO期一般不表达,在GΙ期、S期、G2期和期表达,有报道,Ki-67的表达水平与乳腺癌的分期和淋巴结转移等相关[9],是目前细胞增殖活性研究的重要指标。近年来有学者研究发现Kl-臼的表达能较好地体现肿瘤细胞分化低、增殖快的特点,可作为肿瘤发生发展的早期事件[lO]。本研究结果表明,在食管鳞癌组织中Ki臼阳性表达定位于细胞核,呈过度表达,而与正常组织中表达有显著性差异(P<0.05s),Ki-67与分期、组织学分级及有无淋巴结转移有关(P<0.05)。因此,食管鳞癌组织中Ki-67的高表达可提示肿瘤细胞增殖活跃,侵袭性强,易发生转移,预后不良。综上所述,Ki-67能客观反映食管鳞癌的增殖活性,可以成为评价食管鳞癌发生、发展和预后的重要指标之一。

通过对三者的相关性分析发现,Livin和Livin mRNA在食管鳞癌组织中表达呈一致性,呈明显正相关(P<0.O5),Livin和Ki-67,Livin mRNA和Ki-67经过相关性分析均呈明显正相关(P<0.05),提示Livin和Ki-67可能在食管鳞癌的发生、发展中存在一定的协同作用,通过与caspase结合等途径,抑制细胞凋亡;Ki-67还可以通过苴接或间接的途径影响Lhin,共同促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。Livin作为一个新型的凋亡抑制因子,在食管鳞癌黏膜中的表达可作为评估其生物学行为和判断预后的指标。国内目前没有发现食管鳞癌的Livin、Livin mRNA和Ki-67的相关报道,故本实验对Livin、Livin mRNA和Ki-67的作用与相互关系进行了研究,进而为研究食管鳞癌及其他肿瘤的发生机制及诊断、治疗提供了新的靶点,为临床治疗工作提供了相应的理论依据。

4 参考文献

[1]朱雄增.胃肠道癌前病变和癌的WHO诊断标准[J].中华病理学杂志,2003,32(2):168-169.

[2]Parenti A,Leo G,Porzionato A,et al.Expression of survivin,p53,and caspase 3 in Barrett's esophagus carcinogenesis[J].HumPathol,2006,37(1):16-22.

[3]黄青远,赵志龙,崔肃,等.凋亡抑制基因livin在食管癌中的表达[J].中国医科大学学报,2007,36(5):611-613.

[5]向靖,陆友金.Ki-67及Livin在非小细胞肺癌中的表达[J].安徽医学,2012,33(4):405-408.

[6]李梅,姚乐,惠起源.Livin.Ki-67蛋白在胃癌中的表达及意义[J].现代肿瘤医学,2012,19(2):302-305.

[7]邹爱民,高文香,朱文芳.RNAi沉默结肠癌细胞LOVO中Livin基因的表达[J].现代肿瘤医学,2011,19(12):2408-2411.

[8]陈力,李凡.RNA干扰Livin联合顺铂对食管癌细胞Eca-109增殖和凋亡的影响[J].重庆医学,2011,40(34):3442-3444.

[9]Ma YL,Peng JY,Zhang P,et al.Immunohistochemical analysis re-vealed CD34 and Ki67 protein expression as significant prognosticfactors in colorectal cancer[J].Med Oncol,2010,27(6):304-309.

[10]杨欢,陈晓耕,陈新,等.乳腺浸润性导管癌组织Ki-67表达及其分子分型的意义[J].中华肿瘤防治杂志,2012,19(3):212-216.