C6 胶质瘤细胞诱导神经干细胞分化的初步研究
发表时间：2009-09-11 浏览次数：423次
C6 胶质瘤细胞诱导神经干细胞分化的初步研究 佘春华1李文良1*李鹏1谷峰2马勇杰3* （天津医科大学附属肿瘤医院，天津市肿瘤防治重点实验室1脑系肿瘤科；2乳腺病理研究室；3中心实验室， 天津 300060） 摘要:为了探讨C6胶质瘤细胞分泌的因子对神经干细胞分化的作用及机制。本研究从Wistar孕鼠（E17~E18）纹状体组织中分离、培养神经干细胞，将其分离纯化后进行nestin免疫荧光染色鉴定后分为两组进行诱导分化实验。对照组：RPMI1640培养液＋基础培养基（1∶1配制）；处理组：C6胶质瘤细胞培养上清＋基础培养基（1∶1配制）。采用免疫印迹法分析胶质瘤细胞条件培养液作用于神经干细胞后的不同时相（1、3、5 d）MAP2蛋白的表达情况；通过RTPCR检测不同时相（1、3、5 d）MAP2的表达及调控神经干细胞向神经元分化的多种转录因子如：neurogenin3(Ngn3)、neuroD和neuroD2 的mRNA的表达情况。结果显示：处理组MAP2在蛋白和mRNA水平的表达量均明显高于对照组（P<0.01），并且处理组的Ngn3、neuroD和neuroD2的mRNA水平比对照组也有明显升高。上述结果提示，C6胶质瘤细胞条件培养液能够促进神经干细胞向神经元分化，此作用可能与Ngn3、neuroD和neuroD2等转录调控因子表达水平的提高有关。 关键词 神经干细胞胶质瘤分化免疫印迹分析C6胶质瘤细胞 Experimental study on differentiation of neural stem cells induced by C6 glioma cells She Chunhua1, Li Wenliang1, Li Peng1, Gu Feng2, Ma Yongjie3 (1Department of Neurosurgery and Neurooncology，2Department of Breast Pathology and Research Laboratory, 3Department of Core Laboratory, Cancer Institute & Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin, 300060) AbstractTo explore the effect and mechanism of C6 glioma cells derived factors on the differentiation of neural stem cells. The neural stem cells derived from fetal rat brain were isolated, purified and then were treated with C6 glioma cells conditioned medium in vitro. The level of MAP2 expression was detected by Western blot analysis and RTPCR. RTPCR was also performed to evaluate mRNA levels of multiple transcriptional factors such as neurogenin3 (Ngn3), neuroD and neuroD2 which are neural stem cells differentiation regulators. The results showed that both protein and mRNA level of MAP2 in treated group were higher than those of control significantly (P<0.05), furthermore mRNA level of Ngn3, neuroD and neuroD2 in treated group were also increased compared with control. The above results suggest that C6 glioma cells derived factors can promote neural stem cells differentiate into neurons, which probably due to upregulation of neural stem cells differentiation transcriptional factors including Ngn3, neuroD and neuroD2. Key wordsneural stem cells, glioma, differentiation, Western blotting, C6 glioma cells 神经干细胞是具有自我更新和多分化潜能特性的一类多能干细胞，不仅能够促进神经元和胶质细胞的再生以利于脑组织的修复，而且可以通过基因修饰作用于神经系统疾病的基因治疗，为许多难以治疗的神经系统疾病提供新的治疗途径。神经干细胞的分化受多种因素的影响，包括表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、血小板源性神经营养因子(PDGF)、白血病抑制因子(LIF)等［1］。Okuda等［2］的结果表明C6胶质瘤细胞株来源的条件培养液中具有一些尚未确定的因子，可增强海马神经元的存活率，Zaheer等［3］也发现其中包含多种生长因子。目前胶质瘤细胞来源的因子在神经干细胞分化中的作用研究尚未见报道。本实验采用含C6胶质瘤细胞培养上清的条件培养液探讨了C6胶质瘤细胞来源的因子对神经干细胞分化的影响及作用机制。 材料和方法 1.动物和试剂E17~E18 Wistar 大鼠10只（北京维通利华实验动物技术有限公司提供）。DMEM 培养基（Sigma），RPMI1640培养基（Hyclone），Neurobasal Medium 神经细胞液体培养基 （Invitrogen），B27 supplement 培养液添加剂（Invitrogen），基础培养基为（Neurobasal Medium＋B27 Supplement）。鼠抗神经巢蛋白抗体(nestin，Chemicon)，兔抗胶质纤维酸性蛋白抗体（GFAP, Sigma)，鼠抗微管相关蛋白2抗体（MAP2, Sigma)，鼠抗O4抗体（Milipore corporation）。左旋谷氨酰胺（LGlutamine），FITC标记的荧光二抗及碱性磷酸酯酶（AP）标记二抗购自北京中杉生物科技有限公司，RTPCR 引物由北京奥科公司合成。 2.神经干细胞的分离培养体式显微镜下分离胎鼠脑组织，PBS洗2次，剥离脑膜，取纹状体组织，剪碎，用胰酶消化5~8 min，然后使用含10％胎牛血清的DMEM终止消化，用抛光的玻璃吸管反复轻柔吹打制成单细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，弃上清，以神经干细胞基础培养基重悬，200目尼龙网过滤，台盼兰染色后行细胞计数，以5×104/ml的细胞密度种植于10 cm培养皿（Sumilon MS13900；Sumitoko Bakelite）中，37℃、5％CO2 孵箱培养，每4 d更换一次培养液（基础培养基），每5~7 d传代一次［4］。分离培养7 d后，倒置显微镜下可见悬浮生长的细胞球体形成。 3.神经干细胞分化鉴定取神经细胞球重悬于基础培养基中，种植在含有盖玻片（预先用多聚赖氨酸包被）的24 孔板中，37℃、5％CO2 孵箱孵育48 h，PBS洗涤3遍，预冷4％多聚甲醛固定，参照免疫荧光试剂盒说明书，行nestin（1∶50）、MAP2（1∶50）、GFAP（1∶50）、O4（1∶40）的免疫荧光染色。 4.C6胶质瘤细胞培养上清的制备及干细胞的分组培养〖ZK)〗C6胶质瘤细胞接种在10 cm培养皿，37℃、5％CO2孵箱培养，培养液为含有10％胎牛血清的RPMI1640培养液，待细胞铺满约80％时，去除培养液，PBS清洗3遍，更换为不含血清的RPMI1640培养液。 培养24 h后，收集上清以备用。实验中将神经干细胞分为两组：对照组，细胞培养液使用RPMI1640培养液＋基础培养基（1∶1配制）；处理组，细胞培养液使用C6胶质瘤细胞培养上清＋基础培养基（1∶1配制），即为C6 条件培养液。每隔3 d换液一次，倒置显微镜下观察神经干细胞分化形态。分别于1、3、5 d后进行相关检测。5.RTPCR检测采用Trizol细胞裂解液（Invitrogen）裂解细胞，提取神经干细胞在不同时相的总RNA，采用MMLV逆转录酶进行逆转录合成cDNA，然后均进行预变性（94℃，5 min）、变性（94℃，1 min）、退火（55~57℃，1.5 min）、延伸（72℃，1.5 min），20~38个循环进行PCR扩增，各待测基因引物序列及PCR反应相关条件见表1。产物电泳后使用凝胶照相装置扫描凝胶，对电泳条带进行强度值分析，待测基因相对表达强度以相对系数值表示(＝表达产物/βactin值)。 6.免疫印迹分析 分别于1、3、5 d时行细胞裂解，提取总蛋白，制备6％聚丙稀酰胺凝胶，并进行电泳，转膜。一抗为鼠抗MAP2抗体（1∶1 000），洗膜3次，加AP标记抗鼠二抗（1∶5 000）孵育，洗膜3次，配制5 ml BCIP/NBT底物反应液，进行膜显色。以βactin为内参。图像扫描后，利用Quantiscan Demo 软件分析蛋白条带灰度值。 7.统计方法所有实验数据均由平行实验三次取平均值获得，采用SPASS15.0统计软件分析，不同时相两组MAP2表达水平的比较采用两组独立样本的t检验。数据以±s表示， P<0.05为有统计学差异。 结果 1.神经干细胞的培养和分化将分离得到的神经干细胞接种至培养皿，培养7 d后有明显球状团块产生，细胞之间界限不清，球状团块周围有明显光晕，悬浮状态，称之为神经球（neurosphere）(Fig.1A)。神经球特异性表达nestin（Fig.1B），说明了其干细胞属性。神经球贴壁后可分化为神经元（MAP2阳性，Fig.1C）、星形胶质细胞（GFAP阳性，Fig.1D）、少突胶质细胞（O4阳性，Fig.1E），表明神经干细胞的原代培养体系建立成功。 2.C6 条件培养液对MAP2表达的影响对照组和处理组分别在1、3、5 d后，采用RTPCR、Western blot分析检测两组MAP2 的表达情况，结果显示：1 d时两组中MAP2的mRNA及蛋白表达水平未见差异；3 d后两组中MAP2的mRNA表达量具有统计学差异，且处理组MAP2表达量明显高于对照组（P＜0.01, Fig.2），此时MAP2蛋白的表达在两组中未见差别（P＞0.05，Fig. 3）；5 d时处理组中MAP2的mRNA及蛋白表达水平均较对照组有明显提高（P＜0.01, Fig.2,3）。 3.neurogenin3(Ngn3)、neuroD及neuroD2 mRNA的表达采用RTPCR检测1、3、5 d时两组细胞Ngn3、neuroD及neuroD2的表达，结果显示两组中三者的表达均随时间推移逐渐增强。与对照组相比，处理组中各时相的条带亮度明显增强（Fig. 4），提示这三个因子在处理组中的表达增高。 讨论神经干细胞是神经系统发育过程中特殊的细胞群，是能够在适当的微环境中分化产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的一类多能干细胞。在胚胎期神经干细胞存在于纹状体、海马、脑皮层、视网膜、脊髓、嗅球、侧脑室的脑室区、室下区等部位［5］。本实验中从E17~E18大鼠胚胎脑组织中获取并培养的细胞形成悬浮神经细胞球，是神经干细胞体外培养的重要特征。nestin是一种中间丝蛋白，检测其表达是鉴定神经干细胞的最重要、也是最常用的指标之一［6］。在本实验中神经细胞球特异性表达nestin，证明了其干细胞属性。免疫荧光染色检测到神经细胞球分化的细胞分别表达GFAP、O4和MAP2，三者分别为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的特异标志物，进一步确定了神经干细胞的多分化潜能。尽管神经干细胞具有多分化潜能，但其具体分化方向受微环境影响很大，体内外实验均表明不同的诱导分化环境可以产生不同比率、不同类型的神经元和胶质细胞。在本实验中，我们采用C6胶质瘤细胞的条件培养液进行神经干细胞培养，发现处理组神经干细胞分化为神经元的比例比对照组高，提示C6胶质瘤细胞培养上清中含有某些可溶性细胞因子，在诱导神经干细胞向神经元分化中起重要作用，并且这些因子来源于C6胶质瘤细胞。神经干细胞的分化存在多种机制，其向神经元分化主要由碱性螺旋－环－螺旋 (basic helixloophelix，bHLH) 转录因子家族调控，包括Mashl，Ngns1，2，3， NeuroD和Math 家族以及Hes等成员，其中Hes为抑制型，其余为激活型，两种类型的因子相互调控，维持神经系统的发育平衡。bHLH家族是神经干细胞分化过程中重要的转录调控因子，它以同源或异源二聚体形式与DNA上Ebox序列CANNTG结合而发挥作用［79］。根据在神经分化过程中起作用的先后，bHLH转录调控因子又分为决定因子和分化因子。Ngn3属于决定因子，表达于具有多分化潜能的神经干细胞；neuroD及neuroD2为分化因子，表达于神经元或神经元前体细胞［10］。Ma等［11］的研究发现neuroD的表达与Ngns的表达成正相关，但neuroD的过表达不能激活内源性Ngns，这说明Ngns为neuroD的转录激活因子。McCormick等［12］的研究表明neuroD2是比neuroD更下游的调控因子，它在胚胎神经发生的晚期表达，可激活更下游基因如GAP43的启动子。GAP43是一种特异性的与神经细胞发育相关的酸性膜磷脂蛋白，是神经元再生和可塑性的分子标志物。我们在实验中检测发现处理组Ngn3、neuroD及neuroD2表达增高并呈现时相上的相继变化，与神经干细胞向神经元分化的趋势一致，这表明C6胶质瘤细胞来源的因子可能通过调控这三者的表达来诱导神经干细胞向神经元分化。广泛研究证实胶质细胞可分泌胰岛素样生长因子、胶质源性神经营养因子等多种可溶性因子，在神经元及轴突的发育及营养维持方面发挥重要作用［1315］。C6胶质瘤细胞来源因子的作用是否与正常胶质细胞一致，能否引起神经干细胞的异常增殖分化甚至恶性转化尚待证实。在本实验中，我们观察到C6胶质瘤细胞来源因子可引起Ngn3及其下游基因neuroD和neuroD2的表达增高，促进神经干细胞向神经元分化，而具体是哪些因子？其作用机制如何？都有待于下一步深入研究。本实验丰富了对神经干细胞的诱导分化及其调控机制的认识，为神经干细胞的定向诱导分化提供了新的理论基础，同时对于干细胞的推广应用具有重要的参考价值。Sanai等［16］在总结多年来神经干细胞及胶质瘤方面的研究工作后提出“神经胶质瘤可能起源于神经干细胞的异常分化”的理论。最新研究发现从人胶质瘤组织中获得的神经干细胞进行体外培养，细胞增殖后发现其基因具有高度不稳定的特征，并且转化为一种具有肿瘤干细胞特性的细胞［17］。因此，我们不得不思考胶质瘤与神经干细胞异常分化的内在联系，胶质瘤来源的因子能否稳定地诱导神经干细胞的定向分化并应用于临床治疗期望于研究者们更加深入的研究和探索。参考文献 ［ 1］ 王新宇，张华伟，李新钢 等. 人胚胎纹状体组织提取液对人胚胎神经干细胞分化方向的影响. 解剖学报, 2008;39:175-179 ［ 2］ Okuda S, Saito H, Katsuki H. 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