老年人食管鳞状细胞癌、腺癌和化生

【关键词】  癌,鳞状细胞；食管肿瘤,腺癌；微卫星重复；聚合酶链反应；barrett食管；化生；增生；序列分析

　　摘要:  目的  评估老年人食管鳞状细胞癌(ESCC)、食管腺癌(EADC)和Barrett化生不典型增生腺癌序列DNA微卫星的改变。  方法  应用稀释性PCR技术检测老年人ESCC、EADC和Barrett化生不典型增生腺癌序列中D2S123、D3S1616、D3S1300、BATRII、D5S346、D17S787和D18S61 7个位点DNA微卫星的改变。  结果  在非稀释DNA中，23例老年人ESCC和18例老年人EADC微卫星不稳定性(MSI)的频率分别是47.8% (11/23例)和38.9%(7/18例)，杂合性丢失(LOH)的频率分别是26.1%(6/23例)和16.7%(3/18例)，两者的MSI或LOH频率比较没有显著差别（P＞0.05）。在稀释DNA中，8例老年人正常食管鳞状上皮和Barrett化生异型增生腺癌序列的MSI和LOH频繁出现，尤其在D3S1616、D2S123、D3S1300和D17S787位点上，与非稀释DNA的MSI和LOH频率相比有显著差别（P＜0.05）。  结论  老年人ESCC和EADC微卫星改变没有差别。老年人正常食管鳞状上皮和Barrett化生异型增生腺癌组织DNA的MSI和LOH普遍存在，它们可能是EADC发生发展的早期分子事件，D3S1616、D2S123、D3S1300和D17S787位点的微卫星改变可能在此过程中起着重要作用。

　　关键词:  癌，鳞状细胞；食管肿瘤，腺癌；微卫星重复；聚合酶链反应；barrett食管；化生；增生；序列分析

　　Barrett食管发生腺癌危险性是一般人群的125倍，其中间过程是柱状化生上皮向不典型增生上皮转化，称之为Barrett化生不典型增生腺癌序列[12]。食管鳞状细胞癌(ESCC)和食管腺癌(EADC)是老年人的常见病。老年人反流性食管炎合并的Barrett食管比年轻人的更易发生不典型增生和腺癌[3]。为了更好地了解老年人ESCC和EADC的发生发展过程，笔者检测了ESCC、EADC、正常食管鳞状上皮和Barrett化生不典型增生腺癌序列组织中D2S123、D3S1616、D3S1300、BATRII、D5S346、D17S787和D18S61 7个位点DNA微卫星的改变。

　　1  材料与方法

　　1.1  病例人与标本  选自福建医科大学附属厦门第一医院病理科2002年3月～2005年10月存档手术切除食管癌石蜡标本41例，患者年龄（68.2±9.6）岁（60～80.5岁）；术前未经过化疗和放疗，标本经福建医科大学附属厦门第一医院伦理委员会批准收集。进行常规组织切片,HE染色和病理诊断。组织病理学分析：23例ESCC，18例EADC，其中8例EADC在癌组织旁同时存在Barrett化生和不典型增生上皮。由2位病理医师进行组织病理学分析并核对。

　　1.2  组织病理学分析、显微切割、DNA提取和DNA稀释  先行常规组织切片、HE染色和组织病理学分析，在显微镜下标记所要切割的组织区域。再切厚度为10 μm的组织3片，在显微镜下按照HE染色切片上的标记进行显微切割，取出组织，装入0.5 mL离心管。余下蜡块组织再行常规切片、HE染色并与切割前的切片比较（图1）。切割不同蜡块时均清洁石蜡切片机刀头和刀片，显微切割不同组织均用不同的洁净器械。采用蛋白酶K（10 mmol/L TrisHCl,pH 8.0,100 mmol/L KCl,2.5 mmol/L MgCl2,0.45% Tween 20，2.5 mg/mL蛋白酶K）消化方法提取基因组DNA：组织在50 μL蛋白酶K消化液中95 ℃变性10 min，常温冷却1 h，然后在65 ℃孵育1 h，最后在95 ℃变性10 min去除多余的蛋白酶K，混合物离心（5 000 r/min，5 min），吸出上清液，移至洁净的离心管。DNA质量测定值在1.072 3～1.240 1[D(260 nm)/D(280 nm)],DNA含量为255.36～406.98 ng/μL。8例正常鳞状上皮、Barrett化生上皮、不典型增生上皮和EADC组织的DNA分别按1∶100，1∶1 000，1∶5 000，1∶10 000和1∶50 000稀释度用三蒸水进行稀释。

　　1.3  稀释性PCR和微卫星改变  7个微卫星位点是D2S123，D3S1616，D3S1300，BATRⅡ，D5S346，D17S787和D18S61（PCR引物购自美国Research Genetics公司），分别位于hMSH2，hMLH1，FHIT和TGFβRⅡ基因内，MCCAPC基因之间以及p53和DCC基因邻近。每个不同稀释度（1∶100，1∶1 000,1∶5 000,1∶10 000，1∶50 000）的PCR扩增反应均包含1 μL DNA模板，0.4 μCi:[r32P]ATP放射性标志的微卫星引物，0.2 mmol/L dNTP,10 mmol/L TrisHCl,pH 8.3,1.5 mmol/L MgCl2,50 mmol/L KCl和0.4 U的Taq多聚酶，反应总体积为10 μL。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min→95 ℃ 30 s→58 ℃ 40 s→72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸2 min。

　　A:切割前;B:显微切割后.

　　图1  Barrett食管不典型增生上皮(HE染色  ×200)（略）

　　Fig 1  Epithelial dysplasia in Barrett esophagus (HE staining  ×200)

　　图1  Barrett食管不典型增生上皮(HE染色  ×200)（略）

　　1  Epithelial dysplasia in Barrett esophagus (HE staining  ×200)

　　图2  Barrett食管不典型增生上皮被显微切割后( HE染色  ×200)（略）

　　Fig 2  Epithelial dysplasia after microdissection(HE staining  ×200)

　　PCR引物序列如下：    　　D2S123上游引物：5’ACA TTG CTG GAA GTT CTG GC3’    　　D2S123下游引物：5’CCT TTC TGA CTT GGA TAC CA3’    　　D3S1616上游引物：5’CTC CCT ACC TGA AAA GAT GC3’    　　D3S1616下游引物：5’TCG GCT TAA AGA CTC AGT TTA TT3’    　　D3S1300上游引物：5’AGC TCA CAT TCT AGT CAG CCT3’    　　D3S1300下游引物：5’GCC AAT TCC CCA GAT G3’    　　BATRII上游引物：5’CTT TAT TCT GGA AGA TGC TGC3’    　　BATRII下游引物：5’GAA GAA AGT CTC ACC AGG C3’    　　D5S346上游引物：5’ACT CAC TCT AGT GAT AAA TCG G3’    　　D5S346下游引物：5’GTT TCC ATT GTA GCA TCT TGA C3’    　　D17S787上游引物：5’NED TGG GCT CAA CTA TAT GAA CC3’   

　D17S787下游引物：5’TTG ATA CCT TTT TGA AGG GG3’    　　D18S61上游引物：5’ATT TCT AAG AGG ACT CCC AAA CT3’    　　D18S61下游引物：5’ATA TTT TGA AAC TCA GGA GCA T3’    　　对同一个稀释度DNA标本均进行多次PCR检测，PCR产物用亚甲蓝加样缓冲液按1∶1稀释，该缓冲液包含95%亚甲蓝，0.05%溴芬蓝，0.05%埃先蓝和20 mmol/L EDTA。5 μL的PCR产物与2 μL变性染料混匀后在7%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳2～4 h，凝胶在真空干燥机80 ℃干燥后，用Kodak胶片（美国Kodak公司）曝光6～24 h。    　　微卫星改变分析：以同一例正常鳞状上皮非稀释DNA为对照，与其对比。若电泳图上出现额外新的等位基因条带，被确定为微卫星不稳定性（MSI）。在杂合子中，等位基因上出现≥2倍放射性密度减弱，被确定为杂合性丢失（LOH）。为了保证等位基因在放射性自显影胶片上容易辨别出来，可进行多次曝光比较，放射性自显影结果分别由2位医师独立分析并核对。

　　1.4  统计学处理  统计处理应用SPSS 12.0分析，Fisher精确检验。P＜0.05为差别有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  ESCC和EADC中非稀释性DNA微卫星的改变  MSI在ESCC和EADC中分别为47.8%（11/23例）和38.9%（7/18例），LOH分别为26.1%（6/23例）和16.7%（3/18例）。ESCC和EADC比较，MSI或LOH频率没有显著差别（P＞0.05，表1）。

　　2.2  正常食管鳞状上皮和Barrett化生不典型增生腺癌序列稀释性DNA微卫星的改变  8例老年人正常食管鳞状上皮和Barrett化生不典型增生腺癌序列稀释性DNA的MSI和LOH频繁出现，与各种组织非稀释性DNA的结果相比，绝大多数有显著差别（P＜0.05，表1）。DNA稀释度从1∶100倍到1∶5 000倍时，MSI和LOH频率在上述7个位点上的出现逐渐增多，尤其是在D3S1616，D2S123，D3S1300和D17S787位点上。但当DNA稀释到1∶5 000倍以上时，MSI和LOH频率则减少或无实验结果。MSI和LOH的表现形式大多数相同，少数MSI不同，少数LOH出现在不同等位基因上，个别位点有MSI和LOH并存现象（图2，表2）。

　　表1  不同食管组织非稀释和稀释DNA微卫星改变（略）

　　Tab 1  Microsatellite alterations of undilution and dilution DNA in different esophageal tissues

　　表中数据为例数.  MSI:微卫星不稳定性； LOH：杂合性丢失.  与非稀释DNA组比较, ☆:P＜0.05, ☆☆:P＜0.01.

　　表2  不同食管组织非稀释和稀释DNA在7个位点上的微卫星改变（略）

　　Tab 2  Microsatellite alterations of undilution and dilution DNA at 7 loci in different esophageal tissues

　　表中数据为例数.  MSI:微卫星不稳定性； LOH：杂合性丢失.

　　3  讨论    　　食管腺癌的发生是通过Barrett化生不典型增生腺癌序列的过程，很多分子异常，如原癌基因改变、抑癌基因突变、LOH和一些蛋白的异常表达与腺癌的发生发展有关[47]。近年来发现，微卫星的改变在食管腺癌中频繁或不频繁地出现 [810]。本研究的目的是探讨老年人Barrett化生不典型增生腺癌序列和正常鳞状上皮的微卫星改变。采用显微切割技术，确保较丰富和较纯净的组织供研究。    　　研究发现，在老年人ESCC和EADC中，MSI分别为47.8%（11/23例）和38.9%（7/18例），LOH分别为26.1%（6/23例）和16.7%（3/18例），MSI或LOH频率均无显著差别，说明MSI和LOH在老年人ESCC和EADC中较普遍，结果与文献报道相似[8，11]；但Yanagi等认为MSI在ESCC 和EADC中的频率很低，但其研究例数很少[9]。  

　　1:BE非稀释性; 2:N非稀释性; 3:N 1∶100; 4:N 1∶1 000; 5:N 1∶5 000; 6:N 1∶10 000; 7:N 1∶50 000; 8:BE 1∶100; 9:BE 1∶1 000; 10:BE 1∶5 000; 11:BE 1∶10 000; 12:BE 1∶50 000.  ↓和分别为微卫星不稳定性或杂合性丢失.  BE:Barrett食管化生上皮DNA,N:同一病人正常鳞状上皮DNA.

　　图2  稀释DNA微卫星的改变（略）

　　Fig 2  Microsatellite alterations in dilution DNA   

　　箭（↓）和箭头（▲）分别指的是微卫星不稳定性和杂合性丢失.BE示Barrett食管化生上皮DNA，N示同一病人正常鳞状上皮DNA，1∶100～1∶50 000示稀释倍数.

　　图3  稀释DNA微卫星的改变（略）

　　Fig 2  Microsatellite alterations in dilution DNA

　　有学者认为，肉眼可见的肿瘤是一个亚群或几个亚群细胞克隆增长的结果[12]，这暗示一群肿瘤细胞可能共同拥有某些遗传改变。所以，本研究选择Barrett化生不典型增生腺癌序列及其旁正常鳞状上皮进行研究，以探讨微卫星变化是否是它们共同的分子事件，但实验结果显示，在非癌组织非稀释DNA中很少发现微卫星改变。另据报道，混杂在一群基因正常细胞中的几个基因异常细胞是很难被发现的，只有当DNA稀释到0.1%浓度或0.5～3个细胞量的DNA时,这些基因异常的细胞才容易被发现[13]。所以，本研究将DNA模板稀释后行PCR扩增（称为稀释性PCR）再进行微卫星改变分析。结果显示，在Barrett化生不典型增生腺癌序列稀释DNA结果中，MSI和LOH频繁出现，并随DNA稀释度的增加而增多，与非稀释DNA的结果相比较均有显著差别；正常鳞状上皮MSI频率也有显著差别。说明MSI和LOH在上述组织中普遍存在。当稀释度>15 000倍时，MSI和LOH出现的频率就减少或实验结果无法获得，这可能是因为DNA模板太少，PCR产物无法获得的缘故。进一步分析发现，在Barrett化生不典型增生腺癌序列及其旁正常鳞状上皮稀释DNA中，微卫星改变主要集中在D3S1616,D2S123,D3S1300和D17S787位点上。这些共同分子改变提示，在相同环境生长的正常细胞群中，可能有部分的细胞获得微卫星改变并不断克隆扩增，与导致肿瘤有关。    　　本研究表明，微卫星改变普遍存在于老年人正常鳞状上皮和Barrett化生不典型增生腺癌序列中，这些改变从分子水平上支持了Barrett化生不典型增生腺癌序列发展的观点。结果提示，在EADC发生发展过程中，与微卫星改变相关；MSI和LOH可能是早期分子事件，D3S1616,D2S123,D3S1300和D17S787位点微卫星改变在此过程中起着重要作用，它们可能作为EADC早期诊断的分子标志。

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　　基金项目: 厦门市科技基金资助项目（3502Z20052018），厦门市卫生局重点科研基金资助项目（WSK0301）