非小细胞肺癌患者外周血和骨髓中LUNX基因表达的临床意义

作者:吴昊,李浒,章希贤

作者单位：杭州市第一人民医院，浙江 杭州 310006          【摘要】  　　［目的］ 探讨非小细胞肺癌(NSCLC) 患者外周血和骨髓微转移的肺特异性X蛋白（LUNX）基因诊断的临床意义。 ［方法］ 应用荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 技术，对42例肺癌患者和12 例肺良性病变患者的外周血和骨髓中LUNX基因 mRNA 表达进行检测。 ［结果］ 42例肺癌患者有14例在外周血中检测到LUNX基因mRNA的表达，阳性表达率为33.3%，有10例在骨髓中检测到LUNX基因mRNA的表达，阳性表达率为23.8 %。LUNX mRNA的表达与CK-19基因mRNA 的表达率无显著性差异（P>0.05）。外周血和骨髓微转移与肺癌组织学类型、细胞分化程度及TNM分期均存在密切关系(P<0.05)。［结论］ 外周血和骨髓LUNX基因mRNA的表达是检测肺癌微转移的一个有价值的指标，为制定治疗方案和评估预后提供重要参考依据。

【关键词】  非小细胞肺癌　微转移　LUNX基因　外周血　骨髓

　　Abstract: ［Purpose］ To explore the clinical significance of lung-specific X protein (LUNX) gene for diagnosis to micrometastases in peripheral blood and bone marrow in non-small-cell lung cancer patients. ［Methods］The LUNX mRNA expression was detected by TaqMan-based RT-PCR assays in peripheral blood and bone marrow from 42 cases with lung cancer and with 12 benign pulmonary lesion. ［Results］ The positive rates of LUNX mRNA in peripheral blood and bone marrow from lung cancer patients were 33.3 %（14/42） and 23.8 %（10/42） respectively. There was no significant difference between the positive rates of LUNX mRNA and that of CK-19 mRNA（P>0.05）. The micrometastases in peripheral blood and bone marrow were closely related to the pathological type, cell differentiation and TNM stage (P<0.05). ［Conclusions］ LUNX mRNA might be a valuable marker for micrometastases in lung cancer patients, which may also provide important clinical information for prognositic evaluation and proper treatment planning.

    Key words: non-small-cell lung cancer; micrometastases; LUNX gene; peripheral blood; bone marrow

    肺癌是当今世界常见的恶性肿瘤,其发病率逐年上升。在28个发达国家中，肺癌已成为恶性肿瘤中最常见的死亡原因。肺癌中80%为非小细胞肺癌,尽管手术治疗原发性非小细胞肺癌已经取得了巨大的进展，但其中的50%患者仍然在手术根治术后的5年内出现远处转移而死亡[1]。根治性手术失败的主要原因是肿瘤转移到其他器官。微转移（occult micrometastases）是指影像学和常规组织检查不能检测到的循环中的癌细胞以及原发灶以外的微小转移灶。现有的研究结果表明，微转移与患者的预后有一定的相关性，并可早期诊断肿瘤的复发和转移[2~4]。

    微转移发生在肺癌的早期，说明肺癌是一种全身性疾病。我们选取一种新型的肺癌分子标记物——肺特异性X蛋白（lung specific X protein，LUNX）作为研究，以目前广为应用的CK-19标记物为对照，观察其在非小细胞肺癌患者的表达及其预后。同时，对同一个个体的外周血和骨髓同时检测微转移，以期发现临床应用价值。

    1 材料与方法

    1.1 研究对象

    研究对象为2003年3月至2004年3月我院行肺癌根治术的42例患者，已排除远处转移，手术前均行胸部、肝脏、头部、骨骼的影像学检查。其中男性33例，女性9例，平均年龄64岁（38岁~76岁）。

    本组患者的肿瘤分期、TNM分期均根据国际抗癌协会1997年第5版的标准[4]。Ⅰ期18例、Ⅱ期10例、Ⅲa期14例。其中病理类型为腺癌10例，鳞癌18例，腺鳞癌2例，细支气管肺泡癌12例。低分化癌15例，中分化癌17例，高分化癌10例。

    同时设立肺良性病变组：同期接受手术的肺良性病变患者12例，男性7例，女性5例，年龄33岁~62岁。其中肺炎性假瘤4例，肺结核5例，支气管扩张3例。空白对照组：正常健康者外周血，共8例，男性5例，女性3例。

    1.2 实验材料和仪器

    主要试剂：Trizol、Taq酶（杭州博日科技有限公司），逆转录试剂盒、pGEM-T载体、质粒提取试剂盒(Promega公司)， DNAMarker (Fermentas公司)。主要仪器：实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司7700）。

    引物由上海生物工程有限公司合成，探针购于基康生物技术有限公司。

    肺癌细胞株A549购于上海中科院细胞生物所，用于制备标准品模板。

    1.3 实验方法

    1.3.1 标本的获取和初步处理

    所有标本收集过程中严格保持无菌，同时防止上皮细胞污染。在术前1d抽取肺癌组和手术对照组患者以及健康志愿者的外周血约2ml。肺癌组和手术对照组患者在手术中、进胸之前选取手术切口处肋骨抽取约2ml骨髓。以上外周血和骨髓均加入Eppendorf管中并迅速置入液氮中备用。

    1.3.2 RNA的提取和逆转录

    待测标本及肺癌细胞株A549采用Trizol 法提取总RNA。逆转录过程: 取RNA 10μl，70℃水浴5min，加入逆转录缓冲液10μl，dNTP4μl，随机引物10μl，反转录酶5μl，无核酸水21μl，总体积50μl，60min 后终止反应。

    1.3.3 标准品的制作

    LUNX上游引物5＇-GATGGCCACCGTCTCTATGT-3＇，下游引物5＇-AGGTGGATCCTCTCCTGCTT-3＇，产物大小152bp。

    CK19上游引物5＇-GGTCAGTGTGGAGGTGGATT-3＇,下游引物5＇-TCAGTAACCTCGGACCTGCT-3＇， 产物大小198bp。

    PCR反应体系（50μl）无核酸水39.5μl，10×buffer 5.0μl，dNTP1.0μl，上游引物1.0μl，下游引物1.0μl，cDNA 2.0μl，Taq 0.6μl，总体系50μl。扩增条件：95℃ 5min；（94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 1min）×36 cycle。PCR产物胶回收，连接至pGEM-T载体，转化大肠杆菌扩增后大量提质粒。根据文献[5]进行标准品定量，DNA拷贝数为：2.1×1016copy/ml。然后稀释成系列浓度：1×108，1×107，1×106，1×105。

1.3.4 PCR扩增

    标准品和待测样本同时进行PCR扩增，LUNX引物和探针序列：上游引物 5＇-ATAAAGGTCACTGACCCCCA-3＇，下游引物5＇-GACGGTGGCCATCAGGG-3＇，荧光探针序列5＇-(FAM)CTGGAACTTGGCCTTGTGCAGA(TAMRA)-3＇；CK19引物和探针序列：上游引物：5＇-TGAGCAGGTCCGAGGTTA-3＇，下游引物5＇-CTGGGCTTCAATACCGCT-3＇，荧光探针序列5＇-(FAM)GCTGAGCATGAAAGCTGCCTTGGAA(TAMRA)-3＇PCR 反应体系： 5μl cDNA ，28.5μl H2O，5μl 缓冲液，3μl MgCl2，1μl dNTP，上下引物各1μl ，5μl 荧光探针，TaqDNA 聚合酶1.5μl，共50μl 。PCR 扩增条件：95℃ 5min，1 个循环；95℃30s，62℃ 15s，72℃ 15s，40 个循环；72℃延伸10min。标准品与待测样本同时进行PCR扩增，反应结束后,由仪器软件自动生成标准曲线，并计算各个检测样品的mRNA 表达。mRNA 表达量大于1 copy/ml认为表达阳性，mRNA 表达量小于1copy/ml认为表达阴性。

    1.4 统计学处理

    应用SPSS10.0统计软件，采用χ2检验、四格表确切概率法，Logistic 回归进行检验，P<0.05 为差异具有显著性。

    2 结 果

    2.1 NSCLC组和肺良性病变组外周血及骨髓标本中LUNX mRNA和CK-19表达

    见表1。NSCLC组外周血和骨髓LUNXmRNA 表达率分别为33.3%(14/42)，23.8%(10/42)。与CK-19 在它们中的表达无显著性差异（P>0.05）。肺良性病变组外周血及骨髓中均未检测到LUNX mRNA 表达，8份健康人外周血标本无LUNX mRNA 表达，而NSCLC组中表达率为47.6％(20/42)。

    2.2 NSCLC患者外周血、骨髓微转移LUNX mRNA的表达与临床病理特征关系

    见表2。NSCLC患者外周血和骨髓微转移与患者年龄、性别、是否吸烟、原发肿瘤大小部位等均无明显关系（P>0.05），而与肺癌组织学类型、细胞分化程度、P-TNM分期有密切关系(P<0.05)。

    2.3 NSCLC患者外周血和骨髓的相关性

    Logistic回归分析发现，外周血微转移与骨髓微转移之间存在显著性正相关(r=0.782，P<0.05) 。

    3 讨 论

    肿瘤标记物的选择是检测微转移手段的一项主要内容，寻找特异性和敏感性高的肺癌微转移标记物一直是当前研究的焦点之一。肺特异性X蛋白（Lung-specific X protein, LUNX）是日本学者Iwao[6]通过mRNA差异显示技术新近分离的一个组织特异性基因，并于2001年发现其对NSCLC患者手术切除淋巴结的微转移具有很高的特异性和敏感性。现也有个别研究初步发现LUNX在所有肺癌组织中均有表达，表明其可能较现有的肿瘤标记物具有更为好的前景。但也有人对此表示怀疑[7]。肺癌主要以血行和淋巴系统进行转移。在血行转移中，由于骨髓具有独特的结构和血流特点，往往是肿瘤细胞血行转移最早到达并聚集成灶的组织，而外周血作为肿瘤细胞的细胞转移的载体，则是血行转移的必要条件，因而骨髓微转移和外周血肿瘤细胞的临床研究已引起广泛的关注。现有的结果表明，肺癌病人的预后与微转移之间密切相关，术前、术后外周血以及骨髓中检测到微转移者无瘤生存期明显缩短、预后差，两者均可作为独立的预后检测指标[8]。本研究发现LUNX mRNA在所有肺癌组织中均有表达，而在所有手术对照组中的肺组织均未发现其表达，说明LUNX有作为检测肺癌转移的能力。本试验中运用较为广泛的CK-19为对照，观察LUNX在肺癌患者外周血和骨髓的表达情况，结果发现LUNX mRNA在非小细胞肺癌的表达率与CK-19 mRNA的比较虽无统计学意义，但似乎可能有更高的表达率。这说明检测非小细胞肺癌患外周血和骨髓LUNX基因mRNA的表达是检测肺癌微转移的一个有价值的指标。

    在本实验中，我们改变以往术前经患者髂骨中抽取骨髓的方法，而采用术中从手术切口两侧的肋骨中获得骨髓，这种骨髓提取方式免去这项检查给患者所带来的痛苦，并具有临床的可操作性。

    据报道，进入循环系统的肿瘤细胞99%以上将被体内免疫系统清除，仅有极少量癌细胞能继续繁殖[9]。本研究发现外周血中发现的微转移明显多于骨髓中，这与癌转移的“土壤学说”相符合，即癌细胞脱落进入血液循环后，在适合的组织内停留并分裂生长，形成克隆。同时，我们发现骨髓中微转移表达阳性有4例在血液中呈阴性表达，说明外周血检测微转移敏感性高，但也存在漏检的可能，这可能与肿瘤细胞常间断地进入外周血有关。所以外周血虽取样简单，但不能代替骨髓检测。因此，同时检测肺癌病人外周血和骨髓中微转移对于外科医师选择手术适应证，指导肺癌多学科综合治疗，促进新辅助化疗的发展以及预后的监测均有十分重要的意义。

    对非小细胞肺癌微转移与患者临床病理特征的相关性，至今尚无定论。我们的结果发现非小细胞肺癌3种标本的微转移均与患者的年龄、性别、吸烟史、原发肿瘤大小、部位无确切关系，而与细胞分化程度、P-TNM分期以及细胞组织学类型密切相关。在细胞分化程度上，我们发现，无论是外周血还是骨髓中，肺癌细胞分化程度越低，越容易出现转移。这与Shin的研究相一致[10]。虽然与之相类似的还有P-TNM分期，P-TNM越高，肿瘤转移倾向越明显，但很多人都指出目前的常规组织病理分期未考虑到肿瘤细胞微转移灶的存在，也不能精确地反映患者当前的疾病状态，当前的TNM 分期标准应该做进一步的修订。在本试验中，我们考虑到微转移的因素，对参加实验的肺癌患者重新进行TNM 分期，发现肺癌转移性与重新进行分期的具有更好的相关性。不同病理类型的肺癌与肿瘤的播散方式有一定的相关性，腺癌较其他组织学类型肿瘤更容易出现循环系统转移。本试验的结果支持以上论断，与牛中喜等[11]报道相一致。

    综上说明LUNX-mRNA可作为检测非小细胞肺癌微转移分子标记物。

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[11]牛中喜，周清华，徐鹏,等.检测非小细胞肺癌病人外周血和骨髓中肿瘤细胞的临床意义[J].中华胸心血管外科杂志, 2004, 20（6）：355-357.