茶多酚干预移植性S180小鼠肿瘤血管相关因子表达

作者:徐力,李冬云,侯丽,刘杰

作者单位：1.南京中医药大学，江苏 南京 210029；2.北京中医药大学东直门医院，北京 100700        【摘要】  　　［目的］ 应用免疫组化法，观察茶多酚口服、静脉与局部注射三种给药途径对移植性小鼠血管内皮生长因子（VEGF）、金属蛋白酶组织抑制因子Ⅱ（TIMP-2）表达影响，进行茶多酚抗肿瘤新生血管生成研究。［方法］ 建立移植性S180小鼠肿瘤动物模型，随机分茶多酚口服灌胃、局部注射、腹腔注射、人参皂苷Rg3口服灌胃、CTX腹腔注射对照、生理盐水肿瘤模型对照、正常空白对照7组，5d后取肿瘤组织，石蜡包埋、切片，免疫组化染色观察 VEGF、TIMP-2表达。［结果］ 茶多酚口服及局部注射组可明显降低S180荷瘤VEGF表达水平、增加TIMP-2表达水平。［结论］ 茶多酚口服、局部注射具有抗肿瘤新生血管生成作用。

    【关键词】  茶多酚　血管内皮生长因子　金属蛋白酶组织抑制因子Ⅱ

　　The Effect of Tea Polyphenol on Expression of Tumor Blood Vessels Related Factors in Transplantation S180 Mice

    XU Li1, LI Dong-yun2, HOU Li2, et al.

    (1.Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, China;2.Dongzhimen Hospital,

    Affiliated with Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100700, China)

    Abstract:［Purpose］To investigate the effect of tea polyphenol on vascular endogenous growth factor (VEGF) and the expression of tissue inhibitor of metalloproteinase Ⅱ(TIMP-2) in transplantation S180 mice by 3 ways of administration: oral, intravenous and local injection. ［Methods］ Transplantation S180 mice tumor models were randomly divided into 7 groups based on different tea polyphenol administration: oral administration, local injection, intraperitoneal injection, Panaxsaponin Rg3 oral, CTX intraperitoneal injection, normal saline and blank control group. Five days later, the tumor tissue was sliced for examination with immunohistochemical method for VEGF and TIMP-2 expression. ［Results］ Oral administration and local injection of tea polyphenol could markedly reduce expression of VEGF and increase expression of TIMP-2 in S180 bearing tumor. ［Conclusion］ Tea polyphenol by oral administration and local injection reveals inhibiting effect of vascular growth.

    Key words: tea polyphenol; vascular endogenous growth factor; tissue inhibitor of metalloproteinase Ⅱ

    实验研究已经证实，茶多酚不同剂量、不同给药途径对移植性S180小鼠肿瘤具有明显抑制作用，为探讨其作用机制，我们应用免疫组化法，选用血管内皮生长因子（vascular endogenous growth factor，VEGF），金属蛋白酶组织抑制因子Ⅱ（tissue inhibitor of metalloproteinas Ⅱ，TIMP?鄄2）作为检测指标，以判定茶多酚是否能抑制肿瘤新生血管形成。

    1 材料与方法

    1.1 动 物

    雄性ICR小鼠，体重18g～20g，购自南京中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK（苏）2002?鄄0053。

    1.2 药 物

    茶多酚，购自中国农业科学院杭州茶叶研究所，纯度98%。人参皂苷Rg3为参一胶囊，每粒含人参皂苷Rg3 10mg，购自吉林亚泰制药有限公司，批号20030601。三健牌环磷酰胺（CTX）购自上海华联制药有限公司，批号020706。

    1.3 试 剂

    血管内皮生长因子（VEGF）Ab?鄄3(JH121)，购自美国NEOMARKERS公司，批号350P302；金属蛋白酶组织抑制因子Ⅱ（TIMP?鄄2）Ab?鄄5（Clone3A4），购自美国NEOMARKERS公司，批号148SP208；免疫组化超敏鼠组织试剂盒（UltrasensitiveTM S?鄄P），购自福州迈新生物技术开发有限公司。

    1.4 仪 器

    TSJ?鄄Q全自动脱水机，BMJ?鄄Ⅲ型包埋机，BMJ?鄄Ⅲ型病理组织包埋冷冻台，PHY?鄄Ⅲ型病理组织包埋漂烘仪，Reichert Histo STAT切片机，德国产ZEISS三目光学显微镜。

    1.5 方 法

    1.5.1 建立小鼠肉瘤模型

    取ICR小鼠130只，体重18g～20g，雄性。以S180为瘤株进行小鼠肿瘤移植。移植方法如下：选择培养1周的S180腹水瘤小鼠，抽取乳白色腹水，血性腹水不用，加生理盐水适量稀释成1∶4的瘤细胞悬液，调细胞数至1×108左右，每只鼠种0.2ml于右前肢腋窝下，整个接种时间在1h内完成。

    1.5.2 实验分组

    待肿瘤生长至100mm3～300mm3时，将荷瘤小鼠随机分为茶多酚口服灌胃、局部注射、腹腔注射、人参皂苷Rg3口服灌胃、CTX腹腔注射对照、生理盐水肿瘤模型对照、正常空白对照7组。其中，茶多酚不同给药途径3组又分大、中、小3个剂量组。共计13组，每组10只。

    1.5.3 给药剂量与方法

    ①茶多酚口服灌胃组：采用人与实验动物剂量换算法确定大剂量组为6.75mg/d、中剂量组为2.25mg/d、小剂量组为0.75mg/d 。生理盐水配制，每天灌胃0.4ml。②茶多酚腹腔注射组：按茶多酚小鼠腹腔注射LD50换算大剂量组为2.4mg/d、中剂量组为0.8mg/d、小剂量组为0.27mg/d。生理盐水配制，每天注射0.2ml。③茶多酚局部注射组：大剂量组为7.2mg/d、中剂量组为2.4mg/d、小剂量组为0.8mg/d。生理盐水配制，每天注射0.1ml。④人参皂苷Rg3对照组：0.1mg/d生理盐水配制，每天灌胃0.4ml。⑤CTX对照组：按每天50mg/kg腹腔注射给药，每天注射0.2ml。⑥生理盐水肿瘤模型对照组：以0.4 ml/d生理盐水灌胃。⑦正常空白对照组：以0.4 ml/d生理盐水灌胃。按照抗肿瘤药物药理实验方法规定，通常合成化合物、天然产物的纯品给药5次，故连续用药5d，于第6d处死小鼠，并迅速取材，制备标本。

 1.5.4 检测方法

    随机选择12组中每组8只S180荷瘤小鼠肿瘤组织，常规石蜡包埋，HE染色病理观察。另取抑瘤效果较好的茶多酚局部注射大、中剂量组、腹腔注射中剂量组、口服灌胃中剂量组及CTX腹腔注射组、人参皂苷Rg3口服灌胃组与模型对照组石蜡切片分别进行免疫组化染色，以检测VEGF、TIMP?鄄2阳性率。染色步骤如下：①石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH7.4）冲洗3次，每次3~5 min。②根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。③每张切片加1滴或50μl过氧化酶阻断液（试剂A），室温下孵育15min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；PBS冲洗3次，每次5min。④除去PBS液，每张切片加1滴或50μl Ultra V Block（试剂B），室温下孵育5min；PBS冲洗4次，每次5 min。⑤除去PBS液，每张切片加1滴或50μl Rodent Block（试剂C），室温下孵育60min~70min。PBS冲洗4次，每次5min。⑥除去PBS液，每张切片加1滴或50μl 的第一抗体，4℃过夜。⑦PBS冲洗4次，每次5min，除去PBS液，每张切片加1滴或50μl 生物素标记的第二抗体（试剂D），室温下孵育10min~15min。⑧PBS冲洗4次，每次5min。除去PBS液，每张切片加1滴或50μl 链霉菌抗生物素—过氧化物酶溶液（试剂E），室温下孵育10min~15min。PBS冲洗4次，每次5min。⑨除去PBS液，每张切片加2滴或100μl 新鲜配制的DAB溶液。显微镜下观察3min~10min。染色结果为棕色。⑩自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。

    1.6 统计学处理

    VEGF和TIMP?鄄2实验数据为等级资料，采用Ridit检验。当P<0.05时，表示有统计学意义。

    2 结 果

    2.1 血管内皮生长因子测定

    光学显微镜下观察，VEGF阳性细胞为棕黄色颗粒状，阳性表达位于细胞浆。染色结果判定：瘤细胞中阳性＜5%为（+），5%~15%为（++），＞15%为（+++）[3]。结果见表1。

    由表1可以看出，茶多酚局部注射大、中剂量组、人参皂苷Rg3组VEGF表达与肿瘤模型对照组比较有统计学意义（P<0.05）；口服中剂量组及CTX组与肿瘤模型对照组比较有统计学意义（P＜0.01）。而茶多酚腹腔注射组与肿瘤模型对照组比较无统计学意义（P＞0.05）。

    2.2 金属蛋白酶组织抑制因子Ⅱ测定

    以免疫组织化学法半定量判断，TIMP?鄄2阳性细胞为棕黄色颗粒状，阳性表达位于细胞浆。癌组织中未见阳性细胞为（－），阳性细胞在癌细胞团中＜1/3为（+），1/3~2/3为（++），＞2/3为（+++）[4]。结果见表2。

    由表2可以看出，茶多酚局部注射大、中剂量组、口服组及CTX组TIMP?鄄2表达与肿瘤模型对照组相比，有统计学意义（P<0.01），说明茶多酚可明显增加S180荷瘤鼠TIMP?鄄2表达水平，具有抗肿瘤新生血管生成作用。而茶多酚腹腔注射组与肿瘤模型对照组比较无统计学意义（P＞0.05）。

    3 讨 论

    血管内皮生长因子（VEGF）是一种对血管生长有强诱导作用的生长因子，具有刺激血管内皮细胞增殖及新生血管生成作用。VEGF几乎在目前已知的所有肿瘤中都表达，阻断VEGF介导的血管生成将来可能变为治疗肿瘤生长和扩散的常规手段[5]。

    基质金属蛋白酶（MMPs）是一类含锌的蛋白水解酶，在肿瘤新生血管生成过程中，MMPs参与细胞间和基底膜结缔组织的更新和重组。因此，MMPs抑制剂是一类重要的血管生成抑制剂，TIMP作为金属蛋白酶抑制剂可以抑制肿瘤新生血管形成。金属蛋白酶组织抑制因子Ⅱ（TIMP?鄄2）是一种血管生长抑制因子，在血管生成过程中起着重要的作用。另外，基质金属蛋白酶在肿瘤的侵袭和转移过程中担任了重要的角色，通过抑制阻断MMPs的生物活性可以达到阻碍肿瘤转移的目的[4，5]。

    环磷酰胺（CTX）属于细胞周期非特异性抗肿瘤药，有强烈的细胞毒作用，能抑制肿瘤细胞和一切增生迅速的组织（如骨髓、淋巴组织及肠黏膜上皮）的细胞分裂，并对肿瘤血管有一定的抑制作用。人参皂苷Rg3是人参提取的单体活性成分，具有抑制肿瘤新生血管生成作用。本文选择以上两种药物客观地评价茶多酚抗肿瘤新生血管生成的分子机制，结果显示：茶多酚局部注射大剂量与中剂量组、口服中剂量组、CTX组以及人参皂苷Rg3组可明显降低S180荷瘤鼠VEGF表达水平、增高TIMP?鄄2表达水平。从茶多酚对肿瘤血管相关因子影响可以看出，相同的给药途径对两种指标影响效果比较一致。结合茶多酚可明显抑制无血清培养的大鼠主动脉微血管结构研究结果，充分证明茶多酚抗肿瘤机制除能够直接杀伤肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞分化与凋亡、调节免疫机制等综合作用有关外，茶多酚抗肿瘤新生血管生成机制不可忽视。进一步分析实验结果可以看出，茶多酚腹腔注射中剂量组对S180荷瘤鼠的VEGF、TIMP?鄄2均无明显影响。我们分析认为，茶多酚偏于酸性，其pH值明显高于动物体内实际的pH值，故注射后可使注射腹腔炎性变，从而影响了消化道对其有效成分的吸收和利用，使血液中实际药物浓度达不到应有的预期疗效。另外，还有研究证实，茶多酚口服后，被肠壁吸收进入血液循环中与血清蛋白结合成可溶形式，并在血管里循环。在肿瘤血管的新生部位，茶多酚可能通过作用于某些癌基因而抑制血管内皮生长因子表达或提高TIMP?鄄2表达水平起到抗血管生成作用。

【参考文献】[1] 马捷，周晓军，张泰和，等. 人肝癌组织中CD34和血管内皮生长因子的表达及微血管密度的病理意义[J]. 中华病理学杂志，2000，29（4）：248.

[2] 谢玉梅，聂青和，周永兴，等. 肝癌组织中TIMP?鄄1和TIMP?鄄2的表达意义[J].第四军医大学学报，2001，22（19）：1787.

[3] 崔正军，岑瑛. 抑制VEGF在肿瘤治疗中的作用[J]. 华西医学，2005，20 (1) ：171.

[4] 谢玉梅，聂青和，周永兴，等. 基质金属蛋白酶组织抑制因子mRNA及蛋白在肝硬化组织中的定位[J]. 中华传染病杂志，2001，19（6）：352.

[5] 杨福全，戴显伟，赵海鹰. 肝门胆管癌基质金属蛋白酶MMP?鄄2及组织抑制因子TIMP?鄄2表达及意义的研究[J]. 中国现代普通外科进展，2002，5（2）：80.