硒-甲基硒代半胱氨酸诱导肝癌HepG2细胞凋亡作用
发表时间：2009-06-24 浏览次数：687次
作者:魏振利,戴灵
作者单位：浙江大学医学院附属第二医院，浙江 杭州 310009 【摘要】 ［目的］ 探讨硒-甲基硒代半胱氨酸（MSC）对肝癌HepG2细胞的增殖抑制及诱导凋亡的作用。［方法］ 用不同浓度的MSC处理培养的HepG2细胞， MTT法和流式细胞仪分别检测其对细胞生长和细胞凋亡的影响，并检测半胱氨酸蛋白酶3，8，9（caspase-3，8，9）的活性。［结果］ 25μmol/L的MSC处理HepG2细胞24 h后，细胞生长受到明显抑制，出现细胞凋亡，呈现浓度和时间依赖关系。caspase-3，8，9的活性检测显示，25μmol/L MSC处理HepG2细胞24h，48 h后，caspase-3的活性分别升高38.50％和119.72％，caspase-8活性分别升高28.86％和89.42％， caspase-9活性分别升高31.94％和74.28％。50μmol/L的MSC处理24h，48h后，caspase-3活性分别升高82.56％和155.79％，caspase-8活性分别升高48.95％和167.84％，caspase-9活性分别升高55.94％和126.58％。［结论］ MSC抑制HepG2细胞增殖，诱导其凋亡，其凋亡与 caspase-3，8，9的活性增强有关。
【关键词】 硒-甲基硒代半胱氨酸 HepG2细胞 凋亡 半胱氨酸蛋白酶 肝肿瘤
Apoptosis Induced by Se-methylselenocysteine in Liver Carcinoma Cells HepG2
WEI Zhen-li, DAI Ling
(The Second Hospital Affiliated to Medical of Zhejiang University, Hangzhou 310009, China)
Abstract: ［Purpose］ To study the effects of Se-methylselenocysteine (MSC) on the growth inhibition and apoptosis in human liver carcinoma cell line, HepG2 cells. ［Methods］ After HepG2 cells treated with various concentrations of MSC, growth and apoptosis were detected with MTT assay and flow cytometry, and caspase-3, 8, 9 activity was measured. ［Results］ After being treated with 25μmol/L MSC for 24h, the growth of HepG2 cells was inhibited and a marked apoptosis was observed in time-and dose-dependent manner. Caspase-3, 8, 9 assay showed that after treatment of 25μmol/L MSC for 24, 48h, caspase-3 activity was up-regulated 38.50% and 119.72%; caspase-8 activity 28.86% and 89.42%; and caspase-9 activity 31.94% and 74.28%, respectively. While treated with 50μmol/L MSC for 24, 48h, caspase-3 activity was up-regulated 82.56% and 155.79%;caspase-8 activity 48.95% and 167.84%; and caspase-9 activity 55.94% and 126.58%, respectively. ［Conclusion］ MSC inhibits the growth and induces apoptosis in HepG2 cells. The apoptosis is related with the enhanced activity of caspase-3, 8, 9.
Key words: Se-methylselenocysteine; HepG2 cell; apoptosis; caspase; liver neoplasms
硒是一种重要的微量元素，对人体具有重要的作用，其在抗癌中的作用也已经被广泛研究。硒?鄄甲基硒代半胱氨酸（Se?鄄methylselenocysteine，MSC）是一种新型的有机硒化合物，国内外的研究显示它对卵巢癌[1]、乳腺癌[2]、前列腺癌[3]、白血病[4]等肿瘤细胞的生长有抑制作用，但在肝癌中的研究还少见报道。本研究主要探讨MSC诱导HepG2细胞凋亡及其分子机制，以其为肝癌的防治寻找新的药物。
1 材料与方法
1.1 试 剂
MSC、MTT为Sigma公司产品，RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品，半胱氨酸蛋白酶3，8，9（caspase?鄄3，8，9）活性检测试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司生产，小牛血清为杭州四季青生物工程公司生产。
1.2 细胞培养
肝癌HepG2细胞用含10％小牛血清的RPMI 1640培养基培养，其中加入100IU/ml青链霉素，在37℃ 5%CO2恒温培养箱中培养。
1.3 MTT检测
按常规准备细胞，以4 000个/孔接种于96孔板（Costar）中，培养24 h后按6.25，12.5，25，50，75，100， 150μmol/L的浓度加入MSC，不加MSC组作为空白对照，MSC处理24，48，72 h后，每孔加入20μl MTT，培养4h，弃去孔内液体，加入150μl DMSO，震荡10min，在酶标仪上492nm测定光吸收值（OD）。以（实验组OD值/对照组OD值）×100%计算细胞存活率。
1.4 流式细胞仪检测
按常规准备细胞，每瓶接种5×105个细胞，24h后按25，50μmol/L的浓度加入MSC，分别培养24h和48h，消化液消化后PBS洗两次，1 000r/min离心5min，将70％冷乙醇缓慢滴入试管，并不停振荡，使细胞分散固定，PBS洗涤后弃上清，加入1％Triton?鄄X?鄄100，摇匀后静置10min，1 500r/min离心5min，弃上清，加0.01％Rnase 消化10 min，1 500r/min离心5min，弃上清，加入0.005％碘化丙锭染色15min，用300目丝网过滤后上机分析。
1.5 caspase?鄄3，8，9的活性的检测
细胞准备同上，消化后PBS洗涤两次，用试剂盒提供的细胞裂解液裂解细胞，0.05％的考马氏亮兰测定各组细胞蛋白浓度，其余按试剂盒说明书进行操作，405nm测定基质经caspase酶解的反应产物的光吸收值（OD），通过计算凋亡组OD值/对照组OD值确定caspase?鄄3，8，9的活性。
1.6 统计学处理
所有数据以x±s表示，采用t检验作组间均数比较，数据统计分析由SPSS11.5软件处理。
2 结 果
2.1 MSC抑制HepG2细胞生长
表1，图1为不同浓度MSC处理HepG2细胞24，48，72h后，MTT法检测细胞的生长抑制情况。6.25μmol/L MSC对HepG2细胞没有抑制作用。12.5μmol/L MSC有一定的抑制作用，25，50，75，100，150μmol/L MSC具有较为明显的抑制作用，且这种抑制作用呈时间和浓度依赖关系。
2．2 MSC诱导HepG2细胞凋亡
流式细胞检测显示HepG2细胞经25，50μmol/L MSC分别处理24h，48h后出现凋亡，且呈时间和剂量依赖性。25μmol/L MSC处理24h，48h凋亡分别为5.32％和19.64％；50μmol/L MSC处理24h，48h的凋亡分别为9.41％和31.72％。
2．3 MSC上调HepG2细胞caspase?鄄3，8，9活性
用25μmol/L，50μmol/L的MSC分别处理HepG2细胞24h，48h后，caspase?鄄3，8，9的活性显著上升。以对照组活性为100%，25μmol/L的MSC处理24h，48h后，caspase?鄄3活性分别升高38.50％和119.72％，caspase?鄄8活性分别升高28.86％和89.42％，caspase?鄄9活性分别升高31.94％和74.28％。50μmol/L的MSC处理24h，48h后，caspase?鄄3活性分别升高82.56％和155.79％，caspase?鄄8活性分别升高48.95％和167.84％，caspase?鄄9活性分别升高55.94％和126.58％（见表2）。
3 讨 论
硒在肿瘤防治方面的作用已被广泛研究[5]。MSC作为有机硒，是一种有效的细胞生长抑制剂。在对卵巢癌细胞[1]、乳腺癌细胞[2]等的研究表明，其对肿瘤细胞的抑制作用与诱导其凋亡有关。研究MSC对肝癌HepG2细胞的抑制作用及其机制具有十分重要的意义。本研究应用MTT法观察了MSC对HepG2细胞增殖的抑制作用，发现25μmol/L的MSC作用24 h对细胞就具有较强的抑制作用，且呈时间和剂量依赖性。应用流式细胞检测发现，25，50μmol/L MSC处理HepG2细胞24h，48h后，细胞均出现凋亡，说明MSC对HepG2细胞的抑制作用与其诱导细胞凋亡有关。
引起细胞凋亡的原因有很多，其中起中心作用的一类蛋白水解酶是caspase家族成员。它们以酶原的形式存在,一旦被凋亡信号激活,就能通过从天冬氨酸残基处特异地水解关键蛋白而协同地引起细胞凋亡[6]。caspase引起细胞凋亡的途径通常为死亡受体接受死亡信号，引起上游procaspase?鄄8的激活，导致procaspase?鄄9激活,最终导致caspase?鄄3激活[7]。caspase?鄄3处于内外源性凋亡途径的中心环节，是引起细胞凋亡蛋白酶级联反应的核心蛋白酶，活化后的caspase?鄄3破坏核纤层，激活核酸内切酶，促进形成凋亡小体，在细胞凋亡中起着重要作用[8]。我们通过研究发现，MSC处理HepG2细胞后，细胞出现凋亡，同时细胞的caspase?鄄3，8，9的活性显著升高，并且与处理时间和浓度呈正相关，提示MSC可能是通过活化caspase?鄄8，进而活化caspase?鄄9，最终激活caspase?鄄3的信号通路诱导肝癌HepG2细胞的凋亡的。MSC诱导的HepG2细胞的凋亡与caspase家族其他蛋白是否有关以及与其他凋亡途径的关系还不清楚，将是今后我们研究的重点。
本组结果提示MSC对肝癌HepG2细胞具有较强的抑制作用，MSC可能通过活化caspase?鄄3，8，9诱导HepG2细胞凋亡。下一步的工作是要了解MSC诱导肝癌HepG2细胞凋亡的其他机制，为其早日在临床应用创造条件。
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