VEGF在鼻咽癌中的表达及其与预后关系

作者:胡春芳,邵琼,侯景辉

作者单位：华南肿瘤学国家重点实验室，中山大学肿瘤防治中心，广东 广州 510060       【摘要】  　　［目的］ 研究血管内皮生长因子（VEGF）在鼻咽癌中的表达与鼻咽癌患者预后的关系。［方法］ 通过组织芯片技术与免疫组织化学方法回顾性研究1990~2002年期间200例有临床随访资料的鼻咽癌组织中VEGF蛋白的表达情况，应用卡方检验分析鼻咽癌组织VEGF蛋白表达与临床病理参数之间的关系，并通过生存分析计算鼻咽癌组织内VEGF不同表达组的总生存率。［结果］ VEGF在鼻咽癌组织中阳性表达主要位于肿瘤细胞胞浆内。VEGF在鼻咽癌组织中的表达与鼻咽癌患者的TNM分期、复发及远处转移呈正相关（P＜0.05）。VEGF表达阳性及阴性患者5年生存率分别为40.11%和67.75%，两组生存率存在显著性差异（P<0.01）。［结论］ VEGF的表达与鼻咽癌患者TNM分期、复发及远处转移呈明显正相关，其高表达提示预后不良。

【关键词】  鼻咽肿瘤　组织芯片　血管内皮生长因子　预后

　　The Expression of Vascular Endothelial Growth Factor in Nasopharyngeal Carcinoma and Its Relationship with Prognosis

    HU Chun-fang, SHAO Qiong, HOU Jing-hui, et al.

    (State Key Laboratory of Oncology in Southern China, Cancer Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510060, China)

    Abstract: ［Purpose］ To investigate the expression of vascular endothelial growth factor（VEGF） in nasopharyngeal carcinoma (NPC) and its relationship with prognosis of NPC. ［Methods］ The expression of VEGF in 200 cases of NPC with followed-up data from 1990 to 2002 was analyzed by high-throughput tissue microarray technology and immunohistochemistry. The relationship between expression of VEGF and clinical characteristics of the patients with NPC was analyzed with chi-square test. The survival rates between different tissues VEGF expressions in NPC were compared. ［Results］ The positive expression of VEGF in NPC was observed mainly in cytoplasm of tumor cells. And the expression of VEGF in NPC tissue positively correlated with the TNM stage, recurrence and distant metastasis(P＜0.05). The 5 year overall survival rates of patients with positive and negative expression of VEGF were 40.11% and 67.75% respectively. The survival rates of different groups were significantly different by log rank test（P＜0.01）. ［Conclusion］ The expression of VEGF in NPC tissue positively correlated with the TNM stage, recurrence and distant metastasis. High expression of VEGF in patients with NPC predicts poor prognosis.

    Key words: nasopharyngeal neoplasms; tissue microarray; vascular endothelial growth factor; prognosis

    肿瘤的生长及扩散与肿瘤血管生成密切相关，肿瘤在生长过程中能分泌多种物质来促进新生毛细血管的形成。血管内皮生长因子(VEGF)是从黏液细胞或神经母细胞瘤中提取的较强的血管生成因子，能特异性地结合血管内皮细胞，促进内皮细胞生长，增强血管通透性，从而协助肿瘤细胞进入脉管系统，加速肿瘤的扩散与转移，影响患者的预后。1998年Kononen等[1]发明了组织微阵列技术，从而正式建立了现代组织芯片的概念。能将数十、百个标本承载在一个受体蜡块上，允许在一次实验中对多个病人样本的一个分子指标进行测定。本文应用此技术研究VEGF在鼻咽癌组织中的表达与预后的关系。

    1 材料与方法

    1.1 材料来源

    收集中山大学附属肿瘤医院病理科1990~2002年期间200例有完整临床随访资料的鼻咽癌组织标本，因为脱片、无效组织以及部分标本癌组织过少难以判定，最后进入实验的标本总计188例。患者年龄14~86岁，中位年龄47.81岁，其中临床分期早期（TNMⅠ/Ⅱ期）42例，晚期（TNMⅢ/Ⅳ期）146例。

    1.2 组织芯片的制作

    将所收集的石蜡标本分别找出对应的HE片，显微镜下重新阅片，标出癌组织较大的区域，并在相应的石蜡块上作出标记，作为供体石蜡区域。用组织阵列仪空心针在受体石蜡上钻取直径为1mm，深度2mm~3mm的孔径，在供体石蜡所标记区域内取同样大小和深度的组织块种植到受体石蜡对应的孔径内，各阵点分别横向纵向编序，各序号与相应的蜡块及患者临床资料一一对应。并将构建好的组织微阵列模块在60℃烤箱中放置将近1h，使组织块与蜡块溶为一体。

    1.3 组织芯片的免疫组化染色

    应用免疫组化SP法，切片常规脱蜡水化，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，组织抗原微波修复（EDTA缓冲液，pH=8.0），血清封闭非特异性抗原，滴加一抗（购自ZYMED公司，VEGF鼠抗人单克隆抗体，工作液），湿盒4℃冰箱孵育过夜，二抗SP试剂盒为北京中山生物公司产品，DAB显色。

    VEGF表达以肿瘤细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色，根据阳性细胞所占肿瘤细胞的比例来判定表达结果，随机选取4个400倍视野，癌巢区域所占比例的平均数≤10%为（－），11%~20%为（+），21%~50%为（++），＞50%为（+++）。

    1.4 统计方法

    采用SPSS12.0统计分析软件，计数资料采用卡方检验，Life table法计算生存率并绘制生存曲线，Kaplan-Meier法进行单因素生存分析，Log-Rank检验比较各组生存率。

    2 结 果

    2.1 鼻咽癌组织中VEGF蛋白表达与鼻咽癌临床病理指标的关系

    将VEGF在鼻咽癌组织中的表达分为阴性组（－）与阳性组（＋，＋＋，＋＋＋），组织芯片染色结果如图1。

    分析VEGF与临床指标之间的关系，结果显示鼻咽癌组织中VEGF蛋白的表达与鼻咽癌患者的年龄、性别、鼻咽癌患者血清中VCA-IgA 、EA-IgA抗体滴度以及DNA酶的浓度无关（P＞0.05），而与TNM分期、复发及远处转移呈正相关（P＜0.05），见表1。

2.2 188例鼻咽癌患者的总生存曲线

    对188例鼻咽癌患者进行生存分析，Life table法计算总生存率并绘制生存曲线。结果所有患者的5年总生存率为53.70％，生存曲线见图2。

    2.3 TNM分期对鼻咽癌患者生存曲线的影响

    将鼻咽癌患者TNM分期分为早期（Ⅰ＋Ⅱ）和晚期（Ⅲ＋Ⅳ），结果显示，早期和晚期鼻咽癌患者的5年总生存率分别为68.17％和50.46％，晚期鼻咽癌患者的总生存率显著低于早期鼻咽癌患者（Log- Rank，P=0.0195）。

    2.4 VEGF表达对鼻咽癌患者生存曲线的影响

    为了便于进行生存率的统计分析，将VEGF在鼻咽癌组织中的表达结果分为两组，即阴性组（－）和阳性组（+，++，+++），结果显示，VEGF在鼻咽癌组织表达阴性和阳性组5年总生存率分别为67.75％和40.11％（生存曲线见图3），VEGF表达阳性组的总生存率显著低于VEGF表达阴性组（Log-Rank，P=0.0028）。

    2.5 VEGF表达对不同临床分期鼻咽癌生存曲线的影响

    将VEGF在鼻咽癌组织中的表达结果分为两组，即阴性组（－）和阳性组（+，++，+++），将鼻咽癌患者TNM分期分为早期（Ⅰ＋Ⅱ）和晚期（Ⅲ＋Ⅳ），分别对早期和晚期鼻咽癌患者绘制生存曲线。结果VEGF在早期患者鼻咽癌组织中表达阴性和阳性组5年总生存率分别为73.17％和60.46％。两组总生存率差异无显著性（P=0.5540 ）。VEGF在晚期患者鼻咽癌组织中表达阴性和阳性组5年总生存率分别为65.22％和35.03％，VEGF表达阳性组的总生存率显著低于VEGF表达阴性组 （Log-Rank，P=0.0025）。

    3 讨 论

    VEGF能特异性地促进血管内皮细胞分裂增殖，促血管形成，同时增加血管通透性，使血管内成分渗漏，为血管内皮细胞的迁移及血管形成提供基质，在肿瘤的生长和转移中发挥较为重要的作用[2]。VEGF由正常细胞产生和分泌，同时也可由肿瘤细胞产生，主要作用于处于增殖状态下的血管内皮细胞，促进血管形成。在血管形成过程中，还产生一系列细胞因子，也是肿瘤细胞发生转移的温床。肿瘤转移最终能否形成，还取决于肿瘤细胞在继发部位是否能获得充足的血供。所以研究肿瘤的血管形成及血管形成与肿瘤转移的关系，是预防、治疗肿瘤转移以及评估患者预后的十分有效的途径。

    近几年的研究资料表明，多种肿瘤都高表达VEGF ，正常组织则极少表达，而且肿瘤组织VEGF 的表达水平与肿瘤复发、转移及预后密切相关。VEGF与肺癌、乳腺癌、结肠癌、肾细胞癌、恶性胶质细胞瘤等多种肿瘤的研究关系表明：VEGF 高表达与肿瘤患者生存期、转移有关, 即VEGF 高表达者易转移, 生存期短[3,4]。头颈部癌中VEGF的表达与患者预后密切相关，已被作为肿瘤侵袭和转移的分子标记物[5]。鼻咽癌中VEGF的过表达与肿瘤血管生成、临床分期、淋巴结转移以及远处转移密切相关[6,7]。最近有文献报道VEGF在EBV阳性肿瘤高表达与该肿瘤患者高复发率、淋巴结阳性率以及低存活率密切相关，同时把VEGF作为鼻咽癌远处转移早期诊断的的一种标记物[8]。Li等[9，10]的研究表明鼻咽癌患者血清VEGF水平的升高也预示患者预后不良，郭翔等[11] 将血清VEGF的表达与组织VEGF的表达结合起来分析鼻咽癌患者预后，结果表明鼻咽癌组织及血清中VEGF蛋白检测均可用于判断鼻咽癌患者远处转移风险，两者联合检测可提高预测患者出现远处转移的能力。

    本研究通过组织芯片技术分析VEGF在鼻咽癌组织中的表达与预后的关系，结果也表明VEGF表达阳性组的鼻咽癌患者生存率显著低于阴性组，尤其是对于晚期鼻咽癌患者，VEGF的表达水平是一个有效的预后判断因子，而且鼻咽癌组织中VEGF的表达与鼻咽癌患者临床分期、复发、转移呈正相关，与上述报道结果相一致，进一步证明VEGF是判断鼻咽癌患者预后的分子标记物。鼻咽黏膜组织淋巴管、血管丰富，且通透性高，虽然鼻咽癌原发灶很小，但癌细胞常易早期经淋巴道转移，在同侧颈部形成肿块，或经血道转移至肝、肺和骨，60％以上鼻咽癌患者首次就医已发生局部转移。

    另外，本研究采用组织微阵列技术结合免疫组化方法，一次实验同时检测200份不同患者组织标本，检测效率高。而且同一芯片上多个组织样本处于同一个检测平台，实验条件相同，排除了因为实验条件不同而带来的染色效果的差异，增强了结果的可信度。我们的研究结果与文献所报道基本相符，充分说明组织微阵列技术是一种快速高效的分子生物学研究方法，适合于进行大样本的回顾性研究，也可与基因芯片技术相结合，用于筛选与疾病发生发展相关的分子标记物。

【参考文献】  [1] Kononen J, Bubendorf L. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens[J]. Nat Med, 1998, 4(7): 844-847.

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[7] Zhao SP,Wang CL. Expression and clinical significance of vascular endothelial growth factor in nasopharyngeal carcinoma[J]. Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 2003, 28(2):114-116.

[8] Krishna SM, James S, Balaram P. Expression of VEGF as prognosticator in primary nasopharyngeal cancer and its relation to EBV status[J]. Virus Res, 2005, Aug 31,[Epub ahead of print]

[9] Li YH, Shao JY, Li S, et al.Clinical significance of quantitative analysis of serum VEGF, CD44s, and MMP-3 protein in nasopharyngeal carcinoma[J]. Ai Zheng, 2004, 23(9): 1060-1064.

[10] Zhao GQ, Xu Y, Wang Q. Significance of serum vascular endothelial growth factor test before radiotherapy in patients with nasopharyngeal carcinoma[J]. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao, 2005,3(4): 274-277.

[11] 郭翔, 曹素, 洪明晃, 等. VEGF蛋白检测对预测鼻咽癌远处转移风险的价值[J]. 癌症, 2004, 23(10):1171－1175.