脑胶质瘤细胞系对细小病毒MVM和H1易感性的研究

作者:李方,王字玲

作者单位：1.解放军总医院，北京 100853；2.军事医学科学院野战输血研究所，北京 100850       【摘要】  　　［目的］ 测定人胶质瘤细胞系A172，U87MG，U138，U373，和鼠胶质瘤细胞系GL261与MT539对细小病毒MVM和H1的易感性，并观察野生型病毒在肿瘤细胞内部繁殖情况。［方法］ 体外培养肿瘤细胞，分别用不同剂量的MVM和H1病毒感染GL261，MT539和A172，U87MG，U138，U373细胞1h，继续培养5d，每天进行活细胞计数。空斑形成试验测定感染病毒（MOI = 0.1）5d后细胞内部及细胞培养上清中的病毒总量。［结果］ 与未感染细胞（对照）比较，U138，U373，GL261细胞在MOI 2和5的病毒剂量感染后活细胞数目明显减少， U87细胞数基本维持不变，A172和MT539细胞数轻微增加。MOI = 0.1的病毒剂量对细胞的作用与对照没有差异。空斑形成试验结果表明U373和GL261在MOI=0.1的病毒感染5d后细胞内和培养上清中总病毒量略高于初始病毒量，其它细胞的总病毒量均低于初始病毒量。［结论］ 不同胶质瘤对细小病毒的易感性不同，U138， U373，GL261细胞对细小病毒H1或MVM易感，U87细胞次之，A172和MT539细胞不敏感。U373和GL261细胞有弱的产生子病毒的能力。

【关键词】  脑胶质瘤　细小病毒　易感性　肿瘤治疗

　　Susceptibility of Glioblastoma Cells to Wild Type Parvoviruses MVM and H1

    LI Fang1, WANG Zi-ling2

    (1.General Hospital of PLA, Beijing 100853;2.Institute of Transfusion Medicine, Beijing 100850)

    Abstract: ［Purpose］ To evaluate the susceptibility of human glioma cell lines (A172, U87MG, U138, U373) and murine glioma cell lines (GL261 and MT539) to wild type parvoviruses H1, MVM and the replication ability of wild type virus in these tumor cells. ［Methods］GL261, MT539, A172, U87MG, U138 and U373 cells were infected with H1 and MVM virus respectively for 1 hour at different MOI and cultured for 5 days in vitro. The number of living cells were counted every day. Total amount of virus in cells and supernatant were examined by plaque assay (MOI=0.1) at the fifth day after infection. ［Results］ After infection with MOI 2 and 5, cell number of U138, U373, GL261 decreased markedly, U87MG unchanged and A172 and MT539 increased a litter in comparison with uninfected cells. There was no difference between the doses at MOI 0.1 and control. The total amount of viruses measured at fifth day after infection was lower or similar to the amount of initial in most cell lines. U373 and GL261 samples showed a slight increase of virus compared with initial. ［Conclusions］ Different cell lines show different susceptibility to infection. U138, U373 and GL261 are susceptibility to parvovirus infection in vitro; U87, medium and A172, MT539 are not susceptive. U373 and GL261 have weak potence of producing progeny virions.

    Key words: glioblastoma; parvovirus; susceptibility; cancer therapy

    恶性胶质母细胞瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，常规的治疗方法，如手术切除、放化疗等都远不能达到治疗要求。近年来新出现的一些治疗策略显示出良好的前景，这其中包括溶瘤病毒治疗。细小病毒H1和MVM对肿瘤细胞和转化细胞有选择性杀伤，而对正常细胞则无影响，即具有“亲瘤性”和“溶瘤性”，不整合到宿主的染色体中，迄今未发现对人类有致病性，其抗癌活性也在多种肿瘤和转化细胞内得到证实，因此非常有希望成为一个新的抗肿瘤制剂。本文测定了几种胶质母细胞瘤细胞系对野生型MVM和H1的易感性，探讨用细小病毒MVM和H1治疗胶质母细胞瘤的可能性。

    1 材料与方法

    1.1 材 料

    细胞系：4种人胶质瘤细胞系，A172、U87MG、U138和U373，以及2株鼠胶质瘤细胞系，GL261和MT539，指示细胞 NBE-324K 和A9为德国癌症研究中心肿瘤病毒学研究室赠送。MVM和H1病毒为德国癌症研究中心肿瘤病毒学实验室Dr. Rommelaere赠送。其他试剂购自SIGMA公司。

    1.2 方 法

    1.2.1 细胞培养

    A172、U87MG、GL261和MT539细胞在含10%小牛血清、2mM L-谷氨酸和抗生素的DMEM中培养， U138在10%小牛血清、2mM L-谷氨酸和抗生素的RPMI培养液中培养，U373在10%小牛血清，2mM L-谷氨酸和抗生素的MEM中培养。培养条件为37℃，5% CO2，90% 湿度。

    1.2.2 病毒易感性测定

    感染的前一天在6cm 细胞培养皿中培养2.5×105细胞，次日吸除培养液，加入0.4ml用不含血清的MEM稀释的病毒,病毒剂量为MOI (multiplicity of infection)0.1，2，5，每一剂量接种10盘细胞，置于37℃，5%CO2， 90%湿度孵箱,每隔10min轻轻摇动培养皿1次，以确保细胞与病毒的接触。1h后吸除病毒，加入4ml含10%血清的培养液培养5d，每天取出2盘细胞用台盼蓝染色计数。

    1.2.3 空斑形成试验

    用H1病毒感染指示细胞NBE-324K，用MVM病毒感染指示细胞A9，感染方法同上。预先准备48℃预热的2%顶层琼脂，37℃预热的2×MEM完全培养液(20%血清)，使用前按3:5混合，感染1h后吸除病毒，加入7ml琼脂和2×MEM混合液，待液体凝固后，置细胞培养箱培养5d。第6d加入3ml中性红染色( 染色液配制: 45ml 37℃预热的2×PBS，45ml 48℃预热的2%琼脂，6ml 中性红，用前混合)，12h后空斑计数。

    1.2.4 子病毒产生检测

    培养4×105肿瘤细胞，用MOI=0.1的病毒感染细胞1h，吸除病毒，加入4ml培养液，培养5d。收集细胞培养上清，直接进行空斑试验，细胞用胰酶消化下来，加入细胞裂解液( 50mM Tris.HCl，pH 8.7，0.5mM EDTA)， -80℃ 30min，37℃10min, 反复冻融3次,离心收集上清，稀释后进行空斑试验。将细胞及其培养上清中的病毒数相加得到每一样品的最后结果。

 2 结 果

    2.1 对野生型细小病毒H1和MVM易感性

    为了明确胶质瘤细胞能否作为细小病毒治疗的模型，我们共测试了4种人胶质瘤细胞系，A172， U87MG，U138和U373，以及2株鼠胶质瘤细胞系，GL261和MT539。测试了这些细胞系在体外对野生型细小病毒H1和MVM的易感性。图1显示了各细胞系在不同的病毒剂量下的生长曲线。可以看出各细胞系对病毒感染的易感性不同，A172和MT539细胞生长减慢，U87细胞数基本维持在初始水平，U138、U373、GL261细胞数明显下降，并在感染后4d几乎全部死亡。MOI=2和MOI=5的病毒剂量作用相似。MOI=0.1没有作用（A172，U87，MT539）或有很轻微的作用(U138，U373，GL261)。结果表明U138、U373、GL261细胞对细小病毒H1或MVM易感，U87细胞次之，A172和MT539细胞不敏感。

    2.2 野生型病毒在肿瘤细胞内部繁殖情况检测

    肿瘤细胞在用MOI=0.1的病毒感染5d后，用培养上清和细胞裂解液进行空斑形成实验，结果表明U373和GL261细胞内及培养上清内的病毒总量略大于初始病毒量。A172、U87MG、U138和MT539的病毒总量略低于或等于初始病毒量。图2中A为MOI=0.1的H1病毒感染NBE-324K细胞5d后的空斑数目，B为用MOI=0.1的MVM病毒感染A9细胞5d后的空斑数目。

    3 讨 论

    细小病毒是一类小的（直径20纳米），无囊膜的单链DNA病毒，基因约5 000个核苷酸，它可感染从昆虫、鸟类以及包括人在内的哺乳动物。自主性细小病毒（一般称细小病毒）可自主在宿主细胞中复制，不整合到宿主的染色体中，但病毒的复制依赖于宿主细胞的增殖和分化状态[1]。

    MVM和H1可感染人，并产生病毒血症，但并不产生任何症状。细小病毒的宿主特异性研究表明，MVM和H1对肿瘤细胞和转化细胞有选择性杀伤，而对正常细胞则无明显影响，即具有亲瘤性（oncotropic）和溶瘤性(oncolytic)，所以用野生型病毒杀伤肿瘤以及用重组细小病毒载体转导外源基因的病毒基因治疗研究越来越多。

    H1不仅能抑制动物自发肿瘤的发生，也能抑制诱发肿瘤。众多的研究证明H1对各种类型的肿瘤（肉瘤、癌、白血病），不同诱因（DNA和 RNA肿瘤病毒，化学致癌剂）以及人和动物（鼠、犬）的肿瘤均有抑制作用[1]。在体外的实验系统中，H1亦有明显的抗瘤活性，如转化的纤维母细胞和上皮细胞、人鼻咽癌细胞、人胃癌及肝癌细胞等对H1均敏感[2，3]。H1对短期培养的人原代恶性胶质瘤和神经胶质肉瘤细胞有很强的剂量依赖性的杀伤作用。

    过去的十年间，德国Dr. Rommelaere研究组已经发现，将一些外源基因，如IL-2[4]，MCP-3[5]，IP-10[6]导入细小病毒后得到的重组病毒其抗肿瘤活性比野生型病毒大大提高，表达细胞因子的重组病毒感染肿瘤细胞后可引起小鼠的细胞免疫反应，并明显抑制肿瘤的生长。

    虽然H1病毒的宿主广泛，但不同细胞对H1的易感性有差异。Cornelis等[7]的研究表明，成纤维细胞和上皮细胞对H1感染的易感性是不同的，作者比较了细胞中病毒mRNA的表达情况，表明易感性的差异是与病毒结构和非结构蛋白的转录水平相关，而与病毒的摄入、基因产物在细胞内的定位、病毒mRNA的稳定性、非结构蛋白NS1的磷酸化都没有关系。H1易感的角质细胞其中病毒DNA的复制扩增与H1不敏感的细胞相比也没有变化。所以这几种细胞对H1的易感性主要与病毒基因组的转录水平有关。还有研究表明宿主细胞p53的功能和细小病毒抵抗密切相关。

    本研究初步测定了几种胶质母细胞瘤细胞系对野生型MVM和H1的易感性，探讨用细小病毒MVM和H1治疗胶质母细胞瘤的可能性，结果表明U138、U373、GL261细胞对细小病毒H1或MVM易感，U87细胞次之，A172和MT539细胞不敏感。这些细胞间易感性差异的原因还有待进一步的研究。下一步的研究将从病毒在细胞内的转录情况及细胞基因表达的差异进行。

    考虑到进入到肿瘤细胞的野生型病毒有可能产生子病毒，新病毒造成的二次感染可增强细胞毒性效应。因此我们用空斑形成实验测定了感染病毒（MOI=0.1）5d后细胞内部及细胞培养上清中的病毒总量。结果表明，我们测试的大多数细胞系在病毒感染5d后所含病毒总量都略小于初始的感染量，说明他们不产生子病毒，进入细胞的病毒有可能部分被降解。U373和GL261细胞在感染5d后的病毒量略大于初始病毒量，说明这2株细胞有产生子病毒的能力。

    尽管人们研究细小病毒H1的历史还不长，但已有的研究结果表明细小病毒H1是DNA病毒中惟一的没有致瘤成员的病毒。而且细小病毒只在肿瘤细胞内发挥毒性作用，对正常细胞无影响，不整合到宿主的染色体中，没有插入突变的风险，迄今未发现对人类有致病性，因此非常有希望成为一个新的抗肿瘤制剂。本文的研究结果初步提示U138、 U373、GL261 和U87细胞可作为细小病毒治疗胶质母细胞瘤的细胞模型进行深入的研究。

【参考文献】  [1] Rommelaere J, Cornelis JJ. Antineoplastic activity of parvoviruses[J]. J Virol Methods, 1991, 33(3):233-251.

[2] Maric M, Liu Y. Strong cytotoxic T lymphocyte responses to a macrophage inflammatory protein 1 alpha-expressing tumor: linkage between inflammation and specific immunity[J]. Cancer Res, 1999, 59(21):5549-5553.

[3] Wrzesinski C,Tesfay L,Salome N,et al.Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells[J]. J Virol, 2003, 77(6):3851-3858.

[4] Haag A, Menten P, Van Damme J, et al. Highly efficient transduction and expression of cytokine genes in human tumor cells by means of autonomous parvovirus vectors; generation of antitumor responses in recipient mice[J]. Hum Gene Ther, 2000, 11(4):597-609.

[5] Wetzel K,Menten P, Opdenakker G, et al. Transduction of human MCP-3 by a parvoviral vector induces leukocyte infiltration and reduces growth of human cervical carcinoma cell xenografts[J]. J Gene Med, 2001, 3(4):326-337.

[6] Giese NA, Raykov Z, DeMartino L, et al. Suppression of metastatic hemangiosarcoma by a parvovirus MVMp vector transducing the IP-10 chemokine into immunocompetent mice[J]. Cancer Gene Ther, 2002, 9(5):432-442.

[7] Cornelis JJ,Chen YQ, Spruyt N, et al. Susceptibility of human cells to killing by the parvoviruses H-1 and minute virus of mice correlates with viral transcription[J]. J Virol, 1990, 64(6):2537-2544.

[8] Marta HY, Jan JC, Christel HM, et al. Parvovirus H-1 infection of human glioma cells leads to complete viral replication and efficient cell killing[J]. Int J Cancer, 2004,109:76-84.